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    公开号:WO1990003395A1
    申请号:PCT/JP1989/000966
    申请日:1989-09-22
    公开日:1990-04-05
    发明作者:Satoshi Nakamura；Masami Fukuoka；Tsukio Masegi；Kazuo Kitai；Arata Kato；Yataro Ichikawa
    申请人:Teijin Limited；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 《発明の名称》
    [0003] 新規生理活性ポリペプチ ド、 組換えブラスミ ド、 組換え微生物細胞、 医薬組成物及び精製ポリべプチ ドの回収方法
    [0004] 《技術分野》
    [0005] 本発明は、 新規生理活性ポリペプチ ド、 該ポリペプチ ドをコー ドする D N A領域を含む組換えプラスミ ド、 該プラスミ ドによって形質変換さ れた組換え微生物細胞、 該微生物細胞を用いた該ポリベプチ ドの製造方 法、 該ポリベプチ ドの利用及び精製された該ポリベプチ ドの回収方法に 関する。
    [0006] 更に詳しくは、 抗腫瘍活性を有する新規ポリぺブチ ドに関する前記一 連の技術に関する。
    [0007] 本明細書において、 アミ ノ酸、 ポリペプチ ドは I U P A C - I U B生 化学委員会 （C B N ) で採用された方法により略記するものと し、 たと えば下記の略号を用いる。
    [0008] A la Lーァラニン
    [0009] A rg L -アルギニン
    [0010] A sn L—ァスパラギン
    [0011] A sp L -ァスパラギン酸
    [0012] C ys L一システィ ン
    [0013] G in L - グルタ ミ ン
    [0014] G lu L - グルタ ミ ン酸
    [0015] G ly グリ シン
    [0016] H is L一ヒ スチジン l ie L—イ ソ ロイ シン
    [0017] L eu L一口イ シン
    [0018] Lys Lー リジン
    [0019] Met L -メチォニン
    [0020] Phe L -フエ二ルァラニン
    [0021] P ro L一プロリ ン
    [0022] Ser Lーセリ ン
    [0023] Thr Lー スレオニン
    [0024] Trp L一ト リ ブ ト ファン
    [0025] Tyr Lーチロシン
    [0026] Val L -バリ ン
    [0027] また、 DN Aの配列はそれを構成する各デォキシリボヌクレオチドに 含まれる塩基の種類で略記するものとし、 たとえば下記の略号を用いる。
    [0028] A アデニン （デォキシアデ二ル酸を示す。 ）
    [0029] C シトシン （デォキシシチジル酸を示す。 ）
    [0030] G グァニン （デォキシグァニル酸を示す。 ）
    [0031] T チミ ン （デォキシチミジル酸を示す。 ）
    [0032] さらに、 （H2N) -及び- (COOH) はそれぞれアミ ノ酸配列の ァ ミ ノ末端側及びカルボキシ末端側を示すものであり、 （5')-及び ( 3')はそれぞれ DN A配列の 5'末端側及び 3'末端側を示すものであ る。
    [0033] 《背景技術》
    [0034] Carswellらは、 Bacillus Calraette- Guerin (B C G) などで前 もつて刺激をうけたマウスにェン ド トキシンを投与した後に採取した血 清中に、 移植した MethA肉腫による癌を出血壊死させる物質が含まれ ていることを見出し、 この物質を腫瘍壊死因子 （Tumor Necrosis Factor^ 以下 T N Fと略記することもある） と名づけた [E .A.Cars wellら、 Proc.Natl. Acad. Sci.'U S A , 72 , 3 6 6 6(1 9 75 )]。 この TNFはマウス、 ゥサギ、 ヒ ト等多くの動物中に見られ、 腫瘍細胞 に特異的に、 しかも種を越えて働く ことから、 制癌剤と しての利用が期 待されてきた。
    [0035] 最近になって、 Pennicaらは、 ヒ ト T N Fの cD N Aクローニングを 行ない、 ヒ ト TNF蛋白質の一次構造を明らかにすると共に、 大腸菌に おけるヒ ト TN F遺伝子の発現について報告した [D. Pennicaら、 Na ture、 3 1 2、 724 ( 1 984 ) ] 。 その後、 白井ら [T.Shiraiら、 Nature, 3 1 3、 80 3 ( 1 985 ) 3 、 宗村ら 「宗村ら、 癌と化学 療法、 _ 、 1 6 0 ( 1 9 85 ) ] 、 Wangら [A.M. Wangら、 Scien ce、 228、 1 4 9 ( 1 9 85 ) ] 及び Marmenoutら [ A .Marmenout ら、 Eur. J .B iochem., 1 52、 5 1 5 ( 1 9 85 ) ] が、 ヒ ト TNF 遺伝子の大腸菌における発現について相ついで報告している。
    [0036] このように遺伝子操作技術を用いることによって、 純粋なヒ ト TNF 蛋白質が多量に入手できるようになるに及び、 TN Fの有する抗腫瘍活 性以外の生理活性が明らかになりつつある。 たとえば、 癌末期や重症感 染症患者に見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチンが TNFに非常に類似しており [B.Beulterら、 Nature, 3 1 6、 55 2 ( 1 9 8 5 ) ] 、 カケタチンがリポプロテイ ン ' リパーゼ阻害活性を 有することから、 TNFの投与により血中のト リ グリセリ ド量が増大し、 その結果と して高脂血症のような副作用を引き起こす可能性のあること が示唆された。 また、 それ以外にも、 血管内皮細胞への影響 [J .R.G ambleら、 J .Exp. Med., 1 62 , 2 1 63 ( 1 985) ] 、 骨吸収作 用 [D .R .Beltoliniら、 Nature、 3 1_9 5 1 6 ( 1 986) ] 等 が報告されている。
    [0037] 一方、 近年の遺伝子操作技術の進歩は、 目的とする蛋白質中の任意の アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、 付加したり、 または欠失させる ための遺伝子組換えを可能にした。 このようにして、 天然に存在する蛋 白質を改変して、 特定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、 数多く成されている。
    [0038] ヒ ト TN F蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成されており、 第 1図記載のヒ ト TNF蛋白質のアミ ノ酸配列において、 Cys69及び Cys1 )1のいずれか又は雨方のアミ ノ酸残基の他のアミ ノ酸残基への置 換 （P CT出願公開 WO 86Z04606号、 特開昭 62 - 263 1 9 9号） 、 Gly122の他のアミ ノ酸残基への置換 （特開眧 62 - 263 1 99号、 特開昭 63— 93799号） 、 A la18の他のァミ ノ酸への置換 (特開昭 63— 879 96号） が報告されている。 また、 ァミノ末端側 のアミノ酸の欠失についても、 1 ~6アミ ノ酸欠失 TNFが抗腫瘍活性 を有していること （特開昭 6 1— 5 0923号） 、 1〜7アミノ酸欠失 TNFが抗腫瘍活性を有していること （特願昭 6 1— 90087号） 、 1 ~ 1 0アミ ノ酸欠失 TNFが抗腫瘍活性を有しており、 その比活性は 1〜6、 1〜 7及び 1 ~8アミノ酸欠失 TN Fにおいて極大になること CP CT出願公開 WO 86ノ 023 8 1号） 、 1〜 1 0アミノ酸欠失 T N Fが抗腫瘍活性を有していること （特開眧 62— 27299 1号） 、 1 ~ 1 1アミ ノ酸欠失 TNFが細胞障害活性を有していること （特開眧 6 3— 3 2 4 8 6号） 及び 1 ~ 7アミ ノ酸欠失 TN Fに対し、 さらに 8 ~ 1 0の- Pro- Ser- Asp -のアミ ノ酸を一 Arg - Lys - Argへ置換した改 変 TNFは、 その比活性が大き く上昇することが報告されている （特開 昭 6 3— 1 8 8 3 9 6号） 。
    [0039] そこで、 本発明者らは比活性の向上、 安定性の向上、 反応スぺク トル の広域化、 副作用の低滅化等を目的と して、 ヒ ト TNF蛋白質の新しい 改変体の創製について研究を進めた結果、 本発明に到達した。
    [0040] 《発明の目的》
    [0041] 本発明の第 1の目的は、 新規な抗腫瘍活性を有するポリべプチ ドを提 供することにある。
    [0042] 本発明の第 2の目的は、 増大された抗腫瘍活性を有するポリベプチ ド を提供することにある。
    [0043] 本発明の他の目的は、 前記本発明の新規なポリべプチ ドをコ一ドする DN A領域を含む組換えプラスミ ドを提供することにある。 ， 本発明の更に他の目的は、 前記組換えプラスミ ドによって形質変換さ れた組換え微生物細胞及びその組換え微生物細胞を培養して前記ポリぺ プチ ドを製造する方法を提供することにある。
    [0044] 本発明の更に他の目的は、 前記ポリベプチ ドを含有する医薬組成物を 提供することにある。
    [0045] 本発明の更に他の目的は、 精製された前記ポリペプチ ドの回収方法を 提供することにある。
    [0046] 本発明の更に他の目的は、 以下の説明から一層明白となるであろう。 《発明の開示》
    [0047] 本発明者らの研究によれば前記本発明の目的及び利点は下記式 [ I ] [N H2] - (Met)n- A - X - B - [C O O H] · · · [ I ] 式中、
    [0048] nは 0または 1であり、
    [0049] Aは結合手、 - Asp -、 - Ser - Asp -、 - Pro - Ser - Asp -または
    [0050] - Arg- Lys - Arg-を表わし、
    [0051] Bは- lie- Ile-Ale-Phe -、 -I le-I Ie-Ala- Trp -、
    [0052] - 1 le-I le - Ala -； Leu - Phe -、 - 1 le - 1 le - Trp - Leu -、
    [0053] -Ile-IIe-Phe - Leu -、 - I le-I le-Phe-Phe -、 -I le- I le-Trp-Phe -、 -lie- Phe-Ala- Leu-または- Phe-Ile-Ala-Leu-を表わし、 ただし A 力；結合手、 -Asp -、 - Ser- Asp-または- Pro - Ser- Asp-の時、
    [0054] Bは- Ile-Ile-Ala-Pheであり、
    [0055] Xは -Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn- Pro-Gin- Ala-Glu- Gly-Gln-Leu-Gln-Trp-Leu-Asn-Arg-Arg-Ala-Asn-Ala-Leu-Leu- A la-Asn-G 1 y-Va 1 - G lu-Leu-Arg-Asp-Asn-G 1 n-Leu-Va 1 -Va 1 - Pro - Ser-G lu-G ly-Leu-Ty r-Leu- I le-Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-
    [0056] Gly - Gin - Gly - Cys - Pro - Ser - Thr - His- Val - Leu -： Leu - Thr - His- Thr - Ile-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-T r-Lys-Val-Asn-Leu- Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu- Gly-Al a-Glu-A 1 a-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu-Pro- I le-Tyr-Leu-Gly- Gly-Val-Phe-Gln-Leu-Glu-Lys-Gly-Asp-Arg-Leu-Ser-Ala-Glu- Ile - Asn - Arg - Pro - Asp - Tyr - Leu - Asp- Phe - Ala - Glu - Ser - Gly - Gin - Val-Tyr-Phe-Gly- を表わす
    [0057] で表わされる新規生理活性ポリベプチド、 このポリベプチドをコ一ドす る DN A領域を含有する組換えブラスミ ドを提供することによって達成 され、 またかく して得られた組換えプラスミ ドによって形質転換された 組換え微生物細胞、 この微生物細胞を培養して前記式 [ I ] で表わされ るポリぺブチ ドを製造する方法及びこのポリぺブチ ドを含有する医薬組 成物及び前述した如きポリペプチ ドの精製回収方法を提供することによつ て達成される。
    [0058] 以下本発明について更に詳しく説明する。
    [0059] 本発明の下記式 [ I ]
    [0060] [N H2] - (Met)n- A - X - B - [C O OH] · · · [ I ]
    [0061] (式中 n、 A、 X及び Bの定義は前記と同じ意味を有する）
    [0062] で表わされる新規ポリベプチ ドは、 第 1図に示された No.1 -No.1 5 7までの 1 5 7個のアミ ノ酸配列を有するヒ ト TN Fに対してアミ ノ末 端側及びカルポキシ末端側の両方が改変されている点に特徵を有してい る。
    [0063] この点について更に具体的に説明すると、 前記式 [ I ] において、 - X -の単位は、 第 1図のヒ ト TNFのアミ ノ酸配列において、 第 1 1番 目の Lysから第 1 5 3番目の Lysから第 1 5 3番目の Glyまでのアミ ノ 酸配列と一致している。 しかし、 この- X -のアミ ノ酸配列のアミ ノ末 端側に（Met)n- A -単位が結合し且つカルボキシ末端側に - B -単位 が結合し、 これら両末端のアミ ノ酸配列は、 いずれも第 1図のヒ ト TN Fのァミ ノ酸配列における両末端とは同一ではないことが特徴である。 かく して本発明の前記式 [ I ] で表わされるポリベプチ ドは、 具体的 には下記（ i )~(xiii)のァミ ノ酸配列を含んでいる。 下記（ i )〜（xiii) において n及び xの定義は前記式 [ I ] の同じ意味を有する。 ( i ) - (Me t )n-X- 11 e- 11 e-A 1 a-Phe- ( ii )-(Met)n-Asp-X-I le- 1 le-Ala-Phe- (iii )-( et)n-Ser-Asp-X-I le_Ile_Ala_Phe- (iv)-(Met)n-Pro-Ser-Asp-X-I le-I le-Ala-Phe- (v )-(Met)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-I le-Ala-Phe- Cvi )-(Met)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-I le-Ala-Trp-
    [0064] (vii) -(Met)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-I le-Ala-Leu-Phe-
    [0065] (viii) -(Met)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-I le-Trp-Leu- (ix )-(Met)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-I le-Phe-Leu- C )-( et)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-I le-Phe-Phe-
    [0066] (xi) -(Met)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-I le-Trp-Phe-
    [0067] (xii) -CMet)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-Phe-Ala-Leu- (Xiii)-(Met)n-Arg-Lys-Arg-X-Phe-Ile-Ala-Leu- 前記（ i )~(xiii)のァミノ酸配列は、 大別して （ 1 ) アミ ノ末端側 [(Met)n-A-] が-（Met)n-Arg-Lys-Arg-である（ v )~(xiii)よりなる群 と、 （ 2 ) 該ァミ ノ末端側が- (Met)n-Arg - Lys-Arg-とは異なり且つカル ポキシ末端側 [- B- ] が- Ile-Ile-Ala- Phe-である（ i )~(iv)よりなる 群に分けられる。
    [0068] 本発明の前記式 [I] で表わされるポリペプチドのうち、 ァミ ノ末端 側のアミ ノ酸配列が- (Met)n-Arg-Lys-Arg-である前記（v)~(xiii)から なる群のものが他の群のものより好ましく、 さらにァミ ノ末端側のァミ ノ酸配列が- (Met)n- Arg-Lys-Argであり且つカルボキシ末端側のァミ ノ 酸配列が下記
    [0069] 一 lie - lie - Ala - Phe -、 -I le-I le - Ala - Trp -、
    [0070] -I le-I le - Trp- Leu-または
    [0071] -Ile-Ile-P e-Leu- である、 前記（v)、 （vi)、 （νϊ)または（ix)であるポリペプチ ドが抗腫瘍 活性が高く最も好ましい。
    [0072] 前述したように本発明のポリペプチ ドは前記式 [ I ] で表わされるが、 この式 [ I ] における- X-はヒ ト TNFのアミ ノ酸配列 （第 1図参照） の第 1 1番目の Lysから第 1 5 3番目の Glyまでのァミ ノ酸配列と比べて 改変されてはいない。 し力、し、 本発明のポリペプチ ドにおいて、 この- X -のアミ ノ酸配列は、 本発明の目的を損わない限り若干の改変 （例えば 置換、 欠失または付加） は許容される。 例えば、 前記（iv)のアミ ノ酸配 列において- X-中第 4 5番目の Aspが Asnに置換され且つ第 4 7番目の Gly 力 SSerに置換されたポリペプチ ド、 或いは、 第 5 4番目の Glyが Aspに置 換されたポリべプチ ドであっても、 未置換の- X-のものと同様の活性を 有している。
    [0073] また本発明によれば、 前記式 [ I ] で表わされるポリペプチ ドをコー ドする DN A配列を含むプラスミ ドが提供される。
    [0074] 本発明のプラスミ ドは、 これを宿主に形質転換して得られた微生物細 胞により、 目的とする前記式 [ I ] のポリペプチ ドが産生されるもので あり、 前記式 [ I ] のポリペプチ ドをコー ドする DN A配列のみならず、 ベクターの機能発現のために使用される各種シグナル配列及び転写翻訳 の制御配列 （例えば、 開始ゴトン、 終止ゴドン、 イニシエータ一、 ター ミネ一ター、 ェンハンサ一、 プロモーターなど） をさらに含有している。 かく して本発明によれば、 下記式 [H] で表わされる一本鎖 DN Aと それに相補的な一本鎖 DN Aからなるニ本鎮 DN Aを含むブラスミ ドが 提供される。
    [0075] C5' ) - (Yc)p - Ac - Xc - Be - (Zc)q - (3' ) · · · [Π]
    [0076] 前記式 Πの DN A配列において、 -Ac -、 - Xc-及び- Be-は、 それぞれ前 記式 [ I] のボリペプチドにおける- A -、 -X-及び- B-のアミ ノ酸配列を コ一ドしている DN A配列部分に対応している。 また Yc及び Zcはシグナ ル配列及びノ又は転写翻訳の制御配列を意味する。
    [0077] かく して前記式 [H] において Pまたは qは効率良い遺伝子発現のため に最適な数であり独立して、 0、 1、 2または 3から選ばれる数であり、 また- Yc -、 -Ac-, -Xc-, -Be-及び- Zc-のそれぞれの具体的 DN A配列を 下記に示すが、 これらは一例であって本発明のプラスミ ド中に導入され る D N A配列は下記のものに限定されるものではない。
    [0078] 先ず前記式 [H] における- Ac-及び- Be-については、 前記式 [I] に おける- A-及び- B-のァミノ酸配列にコー ドしているので、 それらに対応 した形で D N A配列を示す。
    [0079] -A- -Ac- -（結合子）
    [0080] -Asp - -GAC- -Ser-Asp- -AGTGAC- -Pro-Ser-Asp- -CCGAGTGAC- -Arg-Lys-Arg- -CGTAAGCGC- -B - -Bc-
    [0081] ■Ile-Ile-Ala-Phe- -ATTATTGCCTTC-
    [0082] I le - 1 le-Ala-Trp- -ATTATTGCCTGG-
    [0083] Ile-Ile-Ala-Leu-Phe- -ATTATTGCCCTGTTC-
    [0084] I le-I le-Trp-Leu- -ATTATTTGGCTG- 一 I le-I le-Phe-Leu- -ATTATTTTCCTG-
    [0085] -I le-I le-Phe-Phe- -ATTATTTTCTTC-
    [0086] - lie - lie - Trp - Phe- -ATTATTTGGTTC-
    [0087] I le-Phe-Ala-Leu- -ATTTTCGCCCTG-
    [0088] -Phe-I le-Ala-Leu- -TTCATTGCCCTG- 前記- Xc-の DN A配列は、 前記式 [ I ] における- X-のアミ ノ酸配列 をコ一ドしていて下記配列であることができる。
    [0089] -Xc-
    [0090] - AAGC CTGTAGC C C ATGTTGTAG C AAAC C C T C AAGC TGAG GGGC AGCTC CAGTGGC TGAAC C GC C GGG C C AATGC C CTGC TGGC C AATGGC GTGGAGC TGAGAGATAAC C AGC T GGTGGTA C CATCAGAG GGC C TGTAC C TCATC TAC TC C CAG GTC C TC TTC AAGGGC C AAGGC TGC C C G TC GAC C C ATGTGCTC C TC AC C C ACAC CATC AGC C GC ATC GC C GTC TC C TAC CAGAC C AAG GTCAA C C TC CTC TCTGC GATC AAGAGC C C C TGC C AGAG G GAGAC C C C AGAG G GGGC TGAG GC C AAG C C ATG GTATGAG C C C ATC TATC TG GGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGAC CGACTCAGCGCTGAAATCAATC GGCCCGAC TATCTCGACTTTGC C GAGTCTGGGCAGGTC TACTTTGGG- また前記式 [II] における- Yc-及び- Zc-は、 それぞれ下記 DN A配列 であることができる。
    [0091] -Xc-
    [0092] -CATCATAAC GGTTCTGGCAAATATTCTGAA ATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTA GTTAACTAGTAC GCAAGTTCAC GTAAAAAG GGTATC GATAATG- -Zc-
    [0093] -TGATAAGCTTAGC CC GCCTAATGAGCGGGC 前記式 [H] における- Ac-Xc-Bc-の単位は、 少なく とも本発明の前記 式 [I ] におけるポリペプチドをコードしている DNA配列である。 本癸明によれば、 前記式 [I] の DNA配列をべクタ一プラスミ ドの 中に導入して祖換えブラスミ ドを得ることができる。 その際使用される ベクタープラスミ ドとしては、 大腸菌用ベクター、 枯草菌用ベクターま たは酵母用ベクターとりわけ大腸菌用べクタ一が一般に有利に利用され る。 以下にブラスミ ドを調製するために使用しうるべクタ一の例を示す。 なお下記に示したベクターの （内） は寄託機関と番号、 製造メーカーま た文献名を示す。
    [0094] ベクター ： C i )大腸菌用べクタ一
    [0095] PBR322CATCC 31344)、 PBR329(ATCC 37264)、 PACYC184(ATCC 37033)、 PDR540CATCC 37282)、 pMB9(ATCC 37019)、 pDR720(Pharraacia),
    [0096] PUC9CATCC 37252)、 PUC19(ATCC 37254)、 pUC13(Pharmacia),
    [0097] pPL- lambda(Pharmac ia) pKK223-3(Pharraacia)^ pYS3lN(S. Nakamura et al..J.Biotechnol. ,8 14 (1988) )、 pAA41(T.Masegi et al. , Agric. Biol. Chem., 52, 1609 (1988) )
    [0098] これらのうち、 PYS31N又は pAA41が好ましい。
    [0099] (ii)枯草菌用ベクター ；
    [0100] 例えば PBS7(ATCC 37280)、 PC194(ATCC 37034)、 PE194(ATCC 37128)
    [0101] (iii)酵母用べクタ一 ；
    [0102] 例えば YEP13(ATCC 31125)、 YCP19(ATCC 37364)、 YRp7(ATCC 37060)、 YIp32(ATCC 37052)、 Y pl7(ATCC 37078)。
    [0103] 本発明によれば、 後述する説明及び実施例から明らかなように、 前記 式 [ I ] におけるポリペプチ ドの具体的なアミ ノ酸配列を、 それぞれコ 一ドしている D N A配列を含有する 1 3個の組換えプラスミ ドが調製さ れた。 得られた組換えブラスミ ドの番号と、 ァミ ノ配列等の番号との対 応関係は下記の通りである。
    [0104] ァミ ノ酸配列の番号 組換えブラスミ ドの番号
    [0105] ( i ) PTNF630
    [0106] ( ii ) PTNF629
    [0107] ( iii ) pTNF628
    [0108] (iv) PTNF621
    [0109] (v) PTNF616 (vi) PTNF617
    [0110] (vii) pTNF620
    [0111] (vfii) pTNF618
    [0112] (ix) PTNF619
    [0113] ( x ) PTNF633
    [0114] Cxi) PTNF634
    [0115] (xii) pTNF643
    [0116] (xiii) pTNF642
    [0117] 前記した本発明の組換えプラスミ ドのうち、 （v)~(xiii)の組換えプ ラスミ ドが好ましく、 特に（V)PT N F 6 1 6、 (vi)pTNF 6 1 7、 (vi)pTNF 6 1 8及び pTNF 6 1 9が好ましい。
    [0118] 本発明において前記組換えブラスミ ドにより形質転換させるべき敬生 物細胞としては、 プラスミ ドに導入された前記式 （E) の DNA配列に よって、 前記式 [ I ] のポリペプチドが産生しうるものであればよく例 えば大腸菌、 枯草菌及び酵母が挙げられるが、 この中で大腸菌 （Esche richia coli) が好ましい。 この大腸菌の具体例と しては、 例えば C600 r-m-(ATCC 33525)、 HBIOKATCC 33694)、 W3110CATCC 27325)、 DHICATCC 33849)、 JA22KATCC 33875)、 JM10KATCC 33876)、 x 1776CATCC 31244) R 1CATCC 31343)及び LE392(ATCC 33572)などが挙げられる。
    [0119] さらに本発明によれば、 下記式 [m]
    [0120] [NH2] -(Met)n- A' - X - B' - [C O OH] · · · [Πί] 式中
    [0121] ηは 0または 1
    [0122] Α は- Arg -: Lys - Arg -であり B'は- Ile-Ile-Ala-Phe -、 I le- 1 le- Ala- Trp -、
    [0123] - 1 le - lie - Ala -! Leu - Phe -、 -I le - 1 le - Trp - Leu -、
    [0124] - Ile-Ile - Phe - Leu -、 - 1 le-I le-Phe-Phe -、 -I le-I le - Trp- Phe -、 一 I le— Phe— Ala—： Leu—、 一 Phe丁 I le— Ala— Leuまたは一 I le— I le— Ala— Leu— であり、
    [0125] Xは前記式 [ I ] における同じ定義のアミ ノ酸配列を表わす で表わされるポリベプチ ドを含有する水性溶液から、 精製されたポリぺ プチ ドを回収する方法が提供される。
    [0126] すなわち、 前記式 [m] のポリペプチ ドを含有する水性溶液、 例えば、 培養上清またはこのポリべプチ ドを産生する微生物細胞を培養した後、 菌体の超音波処理などにより得られたライゼ一卜を、 下記工程（1)〜
    [0127] C3)
    [0128] (1) 陽イ オン交換樹脂に接触せしめて、 該陽イ オン交換樹脂に該ポ リベプチ ドを吸着せしめ、
    [0129] (2) 得られた該ポリペプチ ドが吸着した陽イオン交換樹脂を、 吸着 した該ポリぺプチドが実質的に溶出しない濃度の塩を含む溶媒で 洗浄し、
    [0130] (3) 次いで、 該ポリペプチ ドが吸着した陽イオン交換樹脂を、 該ポ リベプチ ドが溶出しうる濃度の塩を含む溶媒を用いて該ポリぺプ チ ドを溶出 ♦分離させる
    [0131] の処理を行なうことによって精製された前記式 [Π] のボリペプチ ドを 容易に且つ簡単な操作で回収することができる。 かかる本発明の精製回 収方法は、 前記式 [m] で表わされるポリペプチ ドのようにァミ ノ末端 側のアミ ノ酸配列が- Arg-Lys- Arg-であることによつて達成することが できるものと考えられる。 添付した第 1図に示したヒ ト T N Fのポリべ プチ ドを含有する水溶液を前記（1 )~ ( 3 )の処理に付しても精製された ポリぺプチドを得ることは出来ない。
    [0132] 前記本尧明のボリペプチドの精製回収方法は、 簡単に説明すると、 前 記式 [ ΠΠ で表わされるポリペプチドを陽イオン交換樹脂に吸着させ、 吸着した前記ポリベプチ ドが実質的に溶出しない比較的低い塩濃度の溶 媒で洗净し、 次いで塩濃度を上げて吸着した前記ポリべプチドを溶 Wさ せる方法である。
    [0133] ポリベプチドの精製回収方法において、 陽イオン交換樹脂を陽イオン 交換カラムクロマトグラフィーとして用いることができることは、 パイ 口ジェンフリ一化が容易な点、 吸着容量が大きいという点で工業的スケ ールでの精製を行なう上でも優れている。
    [0134] 本発明の精製回収方法の対象となる、 前記式 mで表わされるボリぺプ チドを含有する水性溶液は、 このポリべプチドを産生している組换ぇ微 生物細胞を遠心分雜により集めた後、 適当なバッファーに懸濁させ、 超 音波発生装置を用いて該細胞の破壊を行ない遠心により得られるライゼ ー ト、 または、 同様の方法にして得られる不溶性画分を適当な方法を用 いて可溶化したサンプルのことである。 あるいは、 このポリペプチ ドを 分泌産生している袓換え微生物細胞の培養液を適当なバッファーに透析 した水溶液も含まれる。
    [0135] 工程（1 )で使用される陽イオン交換樹脂としては強酸性あるいは弱酸 性の陽ィオン交換樹脂が挙げられる。 これらの具体例としてスルホプロ ピル * セファロース、 カルボキシメチル ' セファロース、 ホスホ . セフ ァロースなどが挙げられる。 陽イオン交換樹脂は粒状、 繊維状、 膜状等の通常使用する形態で使用 することができる力;、 実用上、 陽イオン交換カラムクロマ トグラフィー と して使用することが好適である。
    [0136] 前記ポリベプチ ドを含有する溶液を陽イオン交換樹脂に接触させるこ とにより、 このポリペプチ ドは陽イオン交換樹脂の表面に吸着される。 得られた吸着陽イオン交換樹脂には目的のポリベプチド以外の不純物が 吸着あるいは付着しているため、 吸着した目的のポリベプチ ドが実質的 に溶出しない漉度の塩を含む溶媒で洗浄を行う。
    [0137] 工程（2)の洗浄に用いる塩を含む溶媒は塩化ナト リゥム等の塩で塩港 度を調整した緩衝液が用いられる。 緩衝液と しては、 ΡΗを中性近辺に 調整したリ ン酸バッファーあるいはト リ ス塩酸バッ ファーを使用するこ とができる。 具体的には、 20raM リ ン酸バッ ファー（pH 7.4)、 2 OmM ト リ ス—塩酸バッ ファー（pH 7.4)などが挙げられる。
    [0138] 塩濃度は 0.1 M以上、 0.1 5 M未満の範囲のものを用いることが好 適である。 0.1 M未満では目的のポリペプチド以外の不純物を完全に 洗净することが困難であるためであり、 一方 0.1 5Mを越えると目的 とするポリべプチ ドが溶出されてしまう可能性があるためである。
    [0139] 洗浄後、 目的のポリペプチ ドが吸着した陽イ オン交換樹脂から、 目的 のボリべプチ ドが溶出しうる濃度の塩を含む溶媒を用いてポリべプチ ド を溶出分離する。
    [0140] 工程（3 )の溶出に用いる塩を含む溶媒は塩化ナ ト リゥム等の塩で塩濃 度を洗浄液よりも高く した緩衝液を用いる。 かかる緩衝液と しては、 P Hを中性に近く調整したリン酸あるいは ト リ ス -塩酸バッファーを使用 することができる。 好ましくは 2 OmMリ ン酸バッファー （pH 7.4) 、 20 mMトリ ス -塩酸バッ ファー （PH 7.4 ) などが挙げられる。
    [0141] 溶出液としての塩を含む溶媒の塩澳度は目的とするポリペプチドによ り異なるが 0.1 5 M以上であればよく、 好ましくは 0.1 8M~0.5 Mの範囲である。 0.1 8 M~ 0.5 Mの範囲であれば、 目的のボリぺプ チドが高純度で得られるが 0.5 M以上で溶出を行うと不純物が少量で あるが溶出されてくる傾向がある。
    [0142] かく して前記した精製回収方法によれば、 髙純度のパイロジェンフリ 一のボリペプチドを、 簡単な手段で得ることができ、 得られたポリぺプ チドは抗腫瘍のための医薬組成物の有効成分として使用することが可能 である。
    [0143] 次に本発明を実施するための態様について更に詳細に説明する。
    [0144] (A) ヒ ト TN F遺伝子のクローン化；
    [0145] ヒ ト TNF遺伝子は、 ヒ ト TNF蛋白質を構成するアミ ノ酸 [D.Pe miicaら、 前出] を指定するいくつかのコ ドンの中から適当なものを選 び、 それを化学合成することによって取得できる。 ヒ ト TNF遺伝子の 設計に際しては、 用いる宿主細胞に最も適したコ ドンを選択すること力 S 望ましく、 後にクローン化及び遣伝子改変を容易に行なえるように適当 な位置に適当な制限酵素による切断部位を設けることが望ましい。 また、 ヒ ト TNF蛋白質をコードする DN A領域は、 その上流に読みとり フ レ ームを一致させた形での翻訳開始コ ドン （ATG) を有することが好ま しく、 その下流方向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コ ドン （TGA、 TAGまたは TAA) を有することが好ましい。 上記翻 訳終止コ ドンは、 発現効率の向上を目的として、 2つ以上タンデムに連 結することがと りわけ好ましい。 さらに、 このヒ ト TNF遺伝子は、 そ の上流及び下流に作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、 適 当なベクターへのクローン化が可能になる。 このようなヒ ト TNF還伝 子の塩基配列の例を、 第 1図に示した。
    [0146] 上記のように設計したヒ ト TNF遺伝子の取得は、 上側の鎖、 下側の 鎖のそれぞれについて、 たとえば第 2図に示したような何本かのオリゴ ヌク レオチ ドに分けて、 それらを化学合成し、 各々オリゴヌクレオチ ド を連結する方法をとるのが望ましい。 各オリゴタクレオチ ドの合成法と してはシエステノレ法 [ H . G . K horana、 "Some Recent Developme nts in Chemistry of Phosphate Esters of Biological I nterest" 、 John Wiley and S ons、 I nc. , New York ( 1 9 6 1 ) ] 、 ト リエステル法 [R . L . Letsingerら、 J . Am. C hem. S oc.， 8 9、 4 8 0 1 ( 1 9 6 7 ) ] 及びホスフアイ ト法 [M . D .Matteucci ら、 Tetrahedron Lett., 2 1 7 1 9 ( 1 9 8 0) ] がある；^、 合 成時間、 収率、 操作の簡便さ等の点から、 全自動 DN A合成機を用いた ホスフアイ ト法による合成が好ましい。 合成したォリゴヌク レオチ ドの 精製は、 ゲル濾過、 イオン交換クロマトグラフィー、 ゲル電気泳動、 逆 相カラムによる高速液体クロマトグラフィ一等を、 適宜単独もしくは組 合せて用いることができる。
    [0147] こうして得られた合成ォリゴヌクレオチ ドの 5'末端側の水酸基を、 たとえば T 4一ポリヌクレオチ ドキナーゼを用いてリ ン酸化した後、 ァ ニーリ ングさせ、 たとえば T 4—DN Aリガーゼを用いて連結する。 合 成オリゴヌク レオチ ドを連結してヒ ト TN F遺伝子を作成する方法と し ては、 合成ォリゴヌクレオチ ドをいくつかのプロックに分けて連結し、 たとえば pB R 3 2 2のよう.なべクタ一に一度クローン化した後、 それ らの各プロックの DN A断片を連結する方法が好ましい。 このようなヒ ト TN F遺伝子を構成するブロックの DN A断片を含むブラス ミ ドとし て、 好ましくは pTNF 1 B R、 pTNF 2 Nまたは pTNF 3が用いら れる。
    [0148] 上記のようにしてクローン化したヒ ト TNF遺伝子を構成する各ブロッ クの DN A断片を連結した後、 適当なプロモータ一、 S D (シャイン - ダルガーノ） 配列の下流につなぐことにより、 発現型遺伝子とすること ができる。 使用可能なプロモーターとして、 トリブトファン ·オペロン · プロモータ一 (trpプロモータ一) 、 ラタ トース · オペ口ン · プロモー ター （lacプロモーター） 、 tacプロモーター、 PLプロモーター、 lppブ 口モーター等があげられるが、 とりわけ trpプロモータ一が好適である。 trpプロモーターを有するブラスミ ドとして、 好ましくは pY S 3 1 Ν、 又は ρΑΑ 4 1が用いられる。 さらに、 発現効率向上を目的として、 ヒ ト T N F遺伝子下流に大腸菌で効率良く可能するターミネータ一を付与 するとができる。 このようなターミネータ一として、 lppターミネータ 一、 trpターミネータ一等があげられるが、 と りわけ trpAターミネータ 一が好適であり、 trpAタ一ミネーターを有するブラス ミ ドとして、 好 ましくは pAA 4 1が用いられる。 この発現型ヒ ト TNF遺伝子を、 た とえば PB R 322由来のベクターにクローン化することにより、 発現 型プラスミ ドが作成できる。 ヒ ト TNF遺伝子凳現型プラスミ ドとして、 好ましくは PTN F 40 1 NN又はpTNF 40 1 Aが用いられる。
    [0149] (B) 新規抗腫瘍活性ポリべプチド遣伝子のクローン化；
    [0150] こう して得られたヒ ト TNF遺伝子発現型プラスミ ドを適当な制限酵 素で切断し、 ヒ ト TN F遺伝子内の特定な領域を除去した後、 適当な塩 基配列を有する合成ォリゴヌクレオチ ドを用いた遺伝子の修復を行なう。 かかる手法を用いることにより、 ヒ ト TN F蛋白質中の任意のァミ ノ酸 を他のアミ ノ酸に置換したり、 付加したり、 または欠失させた形の目的 とするポリベプチ ドをコ一ドする遺伝子を含む発現型ブラスミ ドの作成 が可能になる。 このような抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス ミ ドと して、 好ましくは前記に説明した 1 3種のプラスミ ドが用いられ る。
    [0151] (C)発現確認及び活性評価；
    [0152] ヒ ト TNF遺伝子及び目的とするポリべプチ ド遺伝子を発現させるた めの微生物宿主と しては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母等があげられるが、 と りわけ大腸菌が好ましい。 前記ヒ ト TNF遺伝子発現型ブラスミ ド及び 目的とするポリペプチ ド遺伝子発現型プラスミ ドは、 たとえば公知の方 法 [M. V .Norgardら、 Gene、 、 27 9 ( 1 97 8 ) ] を用いて、 微生物宿主、 たとえばェシエリ ヒア ' コリ C 600 r-m-株 （ A T C C 3 3 5 25 ) に導入することができる。
    [0153] このようにして得られた組換え微生物細胞を、 それ自体は公知の方法 で培養する。 培地としては、 たとえばグルコースとカザミ ノ酸を含む M 9培地 [T .Maniatisら編、 "Molecular C loning" 、 P 440、 Co Id Spring Harbor Laboratory、 New York ( 1 9 82 ) 参照] があげられ、 必要に応じて、 たとえばアンピシリ ン等を添加するのが望 ましい。 培養は目的の組換え微生物に適した条件、 たとえば振とうによ る通気、 撹拌を加えながら、 3 7 °Cで 2 ~ 36時間行なう。 また、 培養 開始時または培養中に、 プロモーターを効率良く機能させる目的で、 3 - / - イ ン ドールァクリル酸等の薬剤を加えることもできる。 培養後、 たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集め、 たとえば リン酸バッ ファーに懸濁させ、 たとえば超音波処理により組換え微生物 細胞を破砕し、 遠心分離により組換え微生物細胞のライゼートを得る。 得られたライゼート中の蛋白質を、 ラウリル硫酸ナトリウム （以下、 S D Sと略すこともある） を含むポリアクリルアミ ドゲルを用いて電気泳 動によって分離し、 ゲル中の蛋白質を適当な方法を用いて染色する。 発 現型ブラスミ ドを含まない微生物細胞のライゼー卜を対照として泳動パ ターンを比較することにより、 ヒ ト TNF遺伝子または抗腫瘍活性ポリ ぺプチド遺伝子の発現を確認する。
    [0154] このようにして得られたヒ ト TNF蛋白質及び抗腫瘍活性ボリべプチ ドの抗癌活性の評価は、 マウスに移植した MethA肉腫を壊死させる効 杲を見る in vivo活性測定法 (Carswellら、 前出） 、 マウス L細胞に 対する細胞障害性を見る in vitro活性測定法 [Ruff、 J . I画 uol.， 1 26、 235 ( 1 9 8 1 ) ] 等により行なえるが、 in vitro活性測 定法が簡便さの点でと りわけ有利である。
    [0155] ヒ ト TN F蛋白質及び抗腫瘍活性ポリベプチドの大腸菌ラィゼートか らの分離 ·精製は、 公知の通常知られている蛋白質の分離 ·精製法に従 えばよいが、 ヒ ト TNF蛋白質等に対する抗体を用いたァフィ二ティー · カラム . クロマ トグラフィ一が利用できる。 その 1例と している ヒ ト T NF蛋白質等に対するマウス · モノクロ一ナル抗体を用いたァフィニテ ィ一 . カラム · クロマトグラフィ一が挙げられる。
    [0156] また本発明のポリべプチドの大部分は前述した陽ィオン交換樹脂を使 用する精製回収方法によっても、 容易にパイ口ジェンフリ一の高純度の ポリべプチ ドを得ることができるので前述した本発明の精製、 回収法 好ましい。
    [0157] 以上記載した種々の方法により得られたヒ ト T N F蛋白質及び抗腫瘍 活性ボリベプチ ド精製品を用いるとにより、 in vi tro抗腫瘍活性 (前 出） を直接算出することが可能となる。
    [0158] かく して本発明によれば、 従来公知のヒ ト T N F蛋白質とは異なる抗 腫瘍活性ポリべプチ ドを得ることが可能になり、 この抗腫瘍活性ポリべ プチドを用いることによって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供 することが可能になった。
    [0159] CD ) 医薬組成物の調製
    [0160] 前記の如く して得られた本発明のポリペプチ ドは、 ヒ ト T N. Fに比べ て極めて髙ぃ抗腫瘍活性を有しており、 または或るものは副作用、 殊に 毒性が低いので、 扰腫瘍剤として使用される。 そのための医薬組成物と しては、 本発明の前記式 [ 1〗 で表わされるポリペプチ ドを有効活性成 分として含み、 その他製薬学的に許容しうる担体を含むものであればよ い。
    [0161] 医薬組成物を調製する場合、 有効活性成分と して使用するボリべプチ ドの抗原性の低減或いは生理活性の増強などを目的と して、 例えばボリ エチレングリ コール （P E G ) 、 デキス トラ ンまたはポリ一 D L -ァラ 二ンなどの公知のポリマ一によってポリべプチ ドを修飾することもでき る。
    [0162] 医薬組成物の形態と しては、 注射用組成物、 坐剤その他が挙げられる 力、 注射用組成物と しては特に静注用組成物と して使用するのが好まし い o
    [0163] 注射用組成物の場合は、 前記式 [ I ] で表わされるポリペプチ ドの薬 学的有効量及び製薬学的に許容しうる担体の混合物であり、 その中には アミ ノ酸、 糖類、 セルロース誘導体、 ポリ ビニルピロ リ ドン類、 無機化 合物類などの一般的に注射用組成物に添加される賦活剤を用いることも できる。 それらの具体例を挙げると、 アミ ノ酸類としては、 グリ シン、 アルギニン、 ァラニン及びそれらの薬学的に許容できる塩等があげられ る。 糖類としては、 マンニ トール、 イ ノ シ トール、 キシリ トール、 乳糖、 グルコース等があげられる。 セルロース誘導体としては力ルポキシメチ ルセルロースナトリウム、 メチルセルロース等があげられる。 ポリ ビニ ルビロリ ドン類としては分子量 1 0 , 0 0 0〜： 1 , 0 0 0，0 0 0のポリ ビニルピロリ ドンがあげられる。
    [0164] 有機酸類としては、 ァスコルビン酸、 クェン酸類等及びそれらの塩が あげられる。 無機化合物類としてはリン酸水素ナ トリウム、 炭酸水素ナ ト リウム、 酢酸ナトリウムなどがある。
    [0165] これら賦形剤を溶解させる液としては、 注射用蒸留水、 注射用生理食 塩水又は注射用リ ンゲル液がある。
    [0166] その他注射液中には、 安定剤、 界面活性剤、 等張化剤、 無痛化剤、 防 腐剤、 緩衝剤などが必要に応じて添加される。 これらの具体例を示すと、 安定剤と してはピロ亜硫酸ナリ トウム、 β -ァスコルビン酸等の抗酸化 剤； E D T A、 チォグリコール剤等のキレー ト剤等があげられる。 界面 活性剤としては、 ボリソルベート、 ポリオキシエチレン誘導体等の非ィ オン性界面活性剤等があげられる。 等張化剤としては塩化ナリ トウム等 が挙げられる。
    [0167] 無痛化剤と してはべンジルアルコール、 キシロカイ ン、 プロ力イ ン等 があげられる。 防腐剤と してはパラベン類、 クロロブタ ノール、 塩化べンザルコニゥ ム、 チメ ロサール （Thimerosal) 等が挙げられる。
    [0168] 緩衝剤と しては、 クェン酸、 酢酸、 リ ン酸等のナ ト リ ウム塩等があげ られる。
    [0169] 《図面の簡単な説明》
    [0170] 第 1図は設計したヒ ト TNF遺伝子の塩基配列を、 第 2図は化学合成 した合成ォリゴヌクレオチ ドの塩基配列を、 それぞれ示したものである。 第 3図、 第 4図及び第 5図は、 ヒ ト TN F遺伝子の一部を有するプラス ミ ド pTN F 1 B R、 pTN F 2 N及び pTN F 3の作成方法を、 それぞ れ示したものである。 第 6図はヒ ト TNF遺伝子発現型ブラスミ ド pT N F 4 0 1 ΝΝの作成方法を、 第 7図は発現べクタ一 PA A 4 1 の作成 方法を、 そして第 8図はヒ ト TNF遣伝子発現型ブラスミ ド pTNF 4 0 1 Aの作成方法を、 それぞれ示したものである。 第 9図は抗腫瘍活性 ポリベプチ ド遺伝子発現型ブラスミ ド PTN F 4 7 1の作成方法を示し たものである。 第 1 0図は抗腫瘍活性ポリペプチ ド遺伝子発現型プラス ミ ド pT N F 6 1 6、 PTN F 6 1 7、 PTN F 6 1 8、 PTN F 6 1 9、 PTN F 6 2 0、 PTN F 6 3 3、 pTN F 6 3 4> pTN F 6 4 2及び P TN F 6 4 3の作成方法を示したものである。 第 1 1図は pTN F 4 1 6 Aの作成方法を示したものである。 第 1 2〜 1 3図は PTN F 6 2 1 ~ 6 2 7の作成方法を示したものである。 第 1 4図は PTN F 6 2 8〜 6 3 2の作成方法を示したものである。 第 1 5 ~ 1 6図は PTN F 6 3 7の作成方法を示したものである。 第 1 7〜 1 9図は PTN F 64 1の 作成方法を示したものである。 第 2 0図は PTN F 6 1 6の発現結果を 示したものである。 第 2 1 図は PTN F 6 1 6にコー ドされる抗腫瘍活 性ポリベプチドの in vitro抗腫瘍活性測定結果を示したものである。 第 2 2図は PTN F 6 1 7によりコー ドされる抗腫瘍活性ポリぺプチド の in vitro抗腫瘍活性測定結果を示したものである。 第 2 3図は PTN F 6 1 8によるコードされる抗腫瘍活性ポリぺプチ ドの vit 抗腫 瘍活性測定結果を示したものである。 第 2 4図は PT N F 6 1 9により コードされる抗腫瘍活性ポリベプチ ドの liL_XiiI2抗腫瘍活性測定結果 を示したものである。 第 2 5図は PT N F 6 2 0によりコードされる抗 腫瘍活性ポリベプチドの in vitro抗腫瘍活性測定結果を示したもので ある。 第 2 6図は PT N F 6 3 3及び 6 3 4によりコー ドされる抗腫瘍 活性ポリベプチドの in vitro抗腫瘍活性測定結果を示したものである。 第 2 7図は PTN F 6 4 2によりコ ードされる抗腫瘍活性ポリべプチド の in vitro抗腫瘍活性測定結果を示したものである。 第 2 8図は PTNF 6 43によりコ ードされる抗腫瘍活性ポリベプチドの in vitro 抗腫瘍活性測定結果を示したものである。 第 2 9図は PTN F 6 3 7に よりコ ードされる抗腫瘍活性ポリベブチドの in vitro抗腫瘍活性測定 結果を示したものである。 第 3 0図は PTN F 6 4 1によりコードされ る抗腫瘍活性ポリべプチ ドの ls_Ji iI2抗腫瘍活性測定結果を示したも のである。 第 31図は実施例 9で得られた精製ポリべプチ ドの抗腫瘍活 性を示したものである。
    [0171] 以下、 実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが、 本発明は以 下の実施例に限定されるものではない。
    [0172] 実施例 1 (ヒ ト TN F遺伝子の設計）
    [0173] 第 1図に示した塩基配列のヒ 卜 TN F遺伝子を設計した、 設計に際し ては、 Pennicaら [D.Pennicaら、 Nature、 3 1 2、 72 4 ( 198 4) ] の報告したヒ ト TNF前駆体 cDN Aの構造遣伝子部分の塩基配 列を基盤と して、 適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設け、 5'側に翻訳開始コ ドン （ATG) を、 そして 3'側に 2個の翻訳終止コ ドン （TGA及び TAA) をそれぞれ付与した。 また、 5'側翻訳開始 コ ドン上流には制限酵素 Cfialによる切断部位を設け、 SD配列と翻訳 開始コ ドン間を適切な状態に保った形でのプロモーターとの連結を可能 にした。 更に、 3'側翻訳終止コ ドン下流には制限酵素 HindBIによる切 断部位を設け、 ベクター · ブラスミ ドと容易に連結できるようにした。 実施例 2 (オリゴヌク レオチ ドの化学合成）
    [0174] 実施例 1で設計したヒ ト TNF遺伝子は、 第 2図に示したように 1 7 本のオリゴヌクレオチ ドに分けて合成する。 オリゴヌクレオチ ドの合成 は全自動 DN A合成機 （ァブラィ ド♦バイォシステムズ、 モデル 3 80 A) を用いて、 ホスフアイ ト法により行なった。 合成オリゴヌクレオチ ドの精製は、 アプライ ド ·バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行 なった。 すなわち、 合成オリゴヌク レオチ ドを含むアンモニア水溶液を 5 5 °Cで一晚保つことによ り、 DN A塩基の保護基をはずし、 セフデッ タス G— 5 0ファイ ン · ゲル （フアルマシア） を用いたゲル濾過によつ て、 高分子量の合成オリゴヌク レオチ ド画分を分取する。 ついで、 7M 尿素を含むポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 20 %) の後、 紫外線シャ ドウイ ング法により泳動パターンの観察を行なう。 目的とす る大きさのバン ド部分を切出して、 そのポリアク リルアミ ドゲル断片を 細かく破砕した後、 2〜 5mfiの溶出用バッ ファー [ 5 0 0mM NH4 O Ac- 1 mM E DTA— 0.1 %S D S (pH 7.5 ) ] を加え、 3 7 °Cで一晚振とう した。 遠心分離により、 目的の DN Aを含む水相の回収 を行なった。 最後に合成ォリゴヌクレオチドを含む溶液をゲル濾過力ラ ム （セフアデックス G— 50) におけることにより、 合成ォリゴヌク レ ォチドの精製品を得た。 なお、 必要に応じて、 ポリアクリルアミ ドゲル 電気泳動を繰り返し、 合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかった。 実施例 3 (化学合成ヒ 卜 TN F遺伝子のクローン化）
    [0175] 実施例 2で作成した 1 7本の合成ォリゴヌクレオチド （TNF - 1〜 TNF - 1 7) を用いて、 ヒ ト TN F遺伝子を 3つのブロックに分けて クローン化した。
    [0176] 0 - 1 - 1.0 >«gの合成ォリゴヌク レオチ ド TNF - 2~TNF - 6 の 5'末端側を、 5 ~ 1 5ユニッ トの T 4一ポリヌクレオチドキナーゼ (E .coliBタイプ、 宝酒造） を用いて、 それぞれ別々にリン酸化する。 リン酸化反応は 1 0~20 12の 5 OmMTris-HCfi (PH 9.5) 、 1 OmM Mg Cfi2、 5mMジチオスレィ トール、 1 0 mM ATP水溶液 中で、 37 °Cで 30分間行なった。 反応終了後、 すべての合成オリゴヌ ク レオチ ド水溶液をすベて混合し、 フエノール抽出、 エーテル抽出によ り T 4 -ポリヌクレオチドキナーゼを失活、 除去する。 この合成オリゴ ヌクレオチド混合液に、 新たに 0.1 ~ 1.0 A gの合成ォリゴヌクレオ' チド TNF - 1及び TN F - 7を加え、 9 0 °Cで 5分間加熱した後室温 まで徐冷して、 アニーリングを行なう。 次に、 これを滅圧乾固した後に、 30 βの 66mM T ris - H C β (pH 7.6 ) 、 6.6 mM MgCfi2、 1 0 mMジチオスレィ トール、 ImM ATP水溶液に溶解させ、 300 ュニッ トの T 4 - DN Aリガーゼ （宝酒造） を加えて、 1 1。0で 1 5時 間連結反応を行なった。 反応終了後、 ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 (ゲル漠度 5%) を行ない、 ェチジゥムブ口マイ ド染色法により泳動パ ターンの観察を行なう。 目的とする大きさ （約 2 2 Obp) のバン ド部分 を切出して、 実施例 2の方法に従ってポリアク リルアミ ドゲルより D N Aを回収する。
    [0177] 一方、 3 y"gの大腸菌用プラスミ ド PB R 3 22 (約 4.4 Kbp) を 3
    [0178] Ο βの 1 0mM Tris- H Cfi (pH 7.5 ) 、 60 mM NaCi2、 7 mM
    [0179] MgCfi2水溶液に溶解させ、 1 0ユニッ トの制限酵素 Ci2al (ニュー イ ングラン ド ·バイオラブズ） を添加して、 30。Cで 1時間切断反応を 行なった。 制限酵素 Cfialによる切断の後、 フエノール抽出、 エーテル 抽出を行ない、 エタ ノ ール沈澱により DN Aを回収する。 この DNAを の 50mM Tris-H Ci2 (pH 7.4 ) 、 1 0 0 mM NaCfi 1 OmM MgS 04水溶液に溶解させ、 1 0ユニッ トの制限酵素 Sal I (宝 酒造） を添加して、 3 7 °Cで 1時間切断反応を行なった。 反応終了後、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0.8%) を行ない、 ェチジゥムブ 口マイ ド染色法により切断パターンの観察を行なう。 プラ スミ ド PB R 3 22の大部分を含む約 3.7 Kbpの DNAの部分に相当するバン ドを 切出し、 そのァガロースゲル断片を 3倍量 （volZwt) の 8M NaCfi 04水溶液に溶解させた。 Chenらのグラスフィルタ一法 [C .W.Chen ら、 Anal. B iochem. 1 0 1、 3 3 9 ( 1 98 0) ] により、 約 3.7 ゎ の01^八断片 （Ci2aI^→Sal I ) をァガロースゲルより回収した。 先に得られたヒ ト TN F遺伝子の一部を含む約 2 201^の0 八断片 について、 前記の方法に準じて末端のリン酸化反応を行なった、 プラス ミ ド PB R 3 22の大部分を含む約 3.7 Kbpの DN A水溶液と混合する。 ェタ ノール沈澱の後、 前記の方法に準じて両 DN A断片の連結反応を行 なった。
    [0180] ェシエリ ヒア . コリ C 60 0 r-tn-株の形質転換は、 通常の CaCfi2 法 （M. V .Norgardらの方法） の改良法で行なった。 すなわち、 5 πιβの L培地 （ 1 %ト リ プトン、 0.5%酵母エキス、 0.5%NaCi2、 pH 7. 2) にェシエリ ヒア · コリ C 6 00r-m-株の 1 8時間培養基を接種し、 菌体を含む培養液の 6 0 Onmにおける濁度 （OD6。0) 力 S 0.3に達する まで生育させる。 菌体を冷たいマグネシウム ' バッ ファー [0.1 M NaCi2、 5mM MgCi22、 5 mM T r is - H C β (pH 7.6、 0 °C) ] 中で 2回洗い、 2mfiの冷したカルシウム · ノくッファー [ l O OmMCaC β2、 250 mM KCi2、 5 mM MgC£2、 5 mM T ris-H C β (pH 7. 6、 0°C) ] 中に再懸濁させ、 0°Cで 25分間放置する。 次に菌体をこ の容量の 1 Z 1 0にカルシウム ·バッファーの中で澳縮し、 連結後の D N A水溶液と 2 ： 1 (vol.： vol.) 混合する。 この混合物を 60分間、 0°Cで保った後、 1 πιβの L B G培地 （ 1 %トリ プトン、 0.5%酵母ェ キス、 l %NaCfi、 0 .08 %グルコース、 PH 7.2 ) を添加し、 3 7 °Cで 1時間振とう培養する。 培養液を、 選択培地 [アンピシリ ン （シグ マ） 30 >"gZmfiを含む L培地プレー ト] に 1 00 fiZプレー トの割合 で接触する。 プレートを 3 0°Cで 1晚培養して、 形質転換株を生育させ る。 得られたアンピシリ ン耐性のコロニーより、 公知の方法を用いて D NAを調製し、 ァガロースゲル電気泳動により、 目的のプラスミ ド pT N F 1 B R (約 4.0 Kbp) の取得を確認した。 第 3図に、 プラスミ ド P TNF 1 B Rの作成方法を示す。
    [0181] 以上と同様な手法により、 合成ォリゴヌクレオチ ド TN F - 8 ~TN F - 1 3を用いてブラスミ ド PTN F 2 N (約 3.1 Kbp) を、 合成ォリ ゴヌク レオチ ド TN F - 1 4 ~T N F - 1 7を用いてプラスミ ド PTN F 3 (約 2.4 KbP) を、 それぞれ作成した。 第 4図及び第 5図に、 ブ ラスミ ド pTN F 2 N及び pTN F 3の作成方法を、 それぞれ示す。 こう して得られたヒ ト TN F遺伝子の一部を含むブラスミ ド pTN F 1 B R、 PR N F 2 N及び pTN F 3の、 合成オリゴヌク レオチ ド使用部分の塩基 配列が設計通りであることは、 マキサム ' ギルバー ト法 [A.M.Maxam ら、 Methods Enzymol., 6 5 , 4 9 9 ( 1 9 8 0 ) 3 によって確認 した。
    [0182] 実施例 4 (ヒ 卜 TNF遺伝子発現型プラスミ ドの作成）
    [0183] 実施例 3で得られたブラスミ ド pTN F 1 B R 1 0 >«gを、 実施例 3と 同様にして制限酵素 Cfial及び Safilで切断し、 ポリアク リルアミ ドゲ ル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) の後、 実施例 2の方法に準じて、 ヒ ト TN F遺伝子の一部を含む約 22 ObpのDNA断片 （CfiaI^→SaflI ) をポ リアクリルアミ ドゲルより回収した。
    [0184] 次に、 実施例 3で得られたプラスミ ド PTN F 2 1 0 ;«gを 1 00 βの l OraM Tris- H Cfi (pH 7.5 ) 、 6 0 mM NaCi2、 7 mM M gCi22水溶液に溶解させ、 40ュニッ 卜の制限酵素 ΡνιιΠ (宝酒造） を 添加し、 3 7 °Cで 1時間切断反応を行なった。 そして、 実施例 3の方法 に準じて制限酵素 Safilによる切断、 ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 (ゲル濃度 5 %) の後、 実施例 2の方法に準じて、 ヒ ト TNF遺伝子の 一部を含む約 1 7 0 pbの D N A断片 （ Safi I— P vull ) をポリアク リル ァミ ドゲルより回収した。
    [0185] また、 実施例 3で得られたブラスミ ド PTN F 3 1 0 も 1 0 0 βの 1 0mM Tris- H Ci2 (pH 7.5 ) 、 6 0 mM NaCfi, 7 mM M gCi22水溶液に溶解させ、 4 0ュニッ 卜の制限酵素 Pvul及び 4 0ュニッ トの制限酵素 Hindm (宝酒造） を添加し、 37 °Cで 1時間切断反応を 行なった。 そして、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5%) の後、 実施例 2の方法に準じて、 ヒ ト TN F遺伝子の一部を含む約 1 1 Obpの DNA断片 （PvuII— HindDI) をボリアクリルアミ ドゲルより 回収した。
    [0186] —方、 大腸菌 trpプロモーターを有するブラスミ ド pY S 3 1 Ν (約 4. 7 Kbp) 5 gを、 上記と同様に制限酵素 Cfial及び Hindmで切断し、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0.8 %) の後、 実施例 3の方法に 準じて、 プラスミ ド PY S 3 1 Nの大部分を含む約 4.7 Kbpの DN A斷 片 （Cfia I<→HindlE) をァガロースゲルより回収した。
    [0187] こうして得られた、 ヒ ト TN F遺伝子の一部を含む約 220bp、 約 1 7 0 bp及び約 1 1 0 bpの 3つの DN A断片とブラスミ ド pY S 3 1 Νの 大部分を含む約 4.7 Kbpの DN Α断片とを混合し、 ェタノール沈殺の 後、 実施例 3の方法に準じて、 T 4 - DN Aリガ一ゼによる連結反応を 行なった。 反応終了後、 実施例 3の方法に準じてェシェリ ヒア · コリ C 6 0 Or- m-株に導入し、 形質転換株の中より目的のヒ ト TNF遺伝子 発現型ブラスミ ド pTNF 4 0 1 NN (約 5 .2 Kbp) を有するクローン を選択した。 第 6図に、 そのプラスミ ド pTNF 4 0 1 NNの作成方法 を示した。
    [0188] また、 上記ブラスミ ド PY S 3 1 Ν 5 を、 上記の方法に準じて制限 酵素 Pvulで部分分解した後、 さらに制限酵素 HindHIで切断し、 ァガ ロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0 .8 %) の後、 実施例 3の方法に準じ て、 trpプロモーターを含む約 2.7 Kbpの DN A断片 [PvuE(2 )— H indin] をァガロースゲルよ り回収した。
    [0189] . 次に第 7図記載の塩基配列を有するオリゴヌク レオチ ドを、 実施例 2 の方法に準じて、 合成 ·精製した。 得られた 2本の合成オリゴヌクレオ チ ドそれぞれ 0.5 について、 実施例 3の方法に準じて、 末端のリン 酸化を行ない、 アニーリ ングの後、 先に得られた約 2.7 Kbpの D N A 断片 [Pvun →HindlE] と混合し、 エタ ノール沈澱の後、 実施例 3の 方法に準じて、 T 4 - DN Aリガーゼによる連結反応を行なった。 反応 終了後、 実施例 3の方法に準じてェシエリ ヒア ' コリ C 6 0 0— r-m- 株に導入し、 形質転換株の中より 目的のプラスミ ド pA A 4 1 (約 2.7 Kbp) を有するクローンを選択した。 このようなブラスミ ドは、 ブラス ミ ド pYS 3 1 Nからコピー数制御領域を除去し、 trpプロモータ一下流 に存在するクローニング ·サイ 卜の下流に大腸菌 trpAターミネーター を付与した形の、 多コピー ·高効率発現べクタ一であり、 第 7図にその 作成方法を示した。
    [0190] このプラスミ ド pA A 4 1 ·2 gを、 上記と同様に制限酵素 Cfia I及 び H indfflで切断し、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル漉度 0.8 %) の後、 実施例 3の方法に準じて、 プラスミ ド PA A 4 1の大部分を含む約 2.7 1^の01^八断片 （Cfia indlH) をァガロースゲルより回収した。 また、 先に得られたヒ ト TN F遺伝子発現型ブラスミ ド P TNF 4 0 1 NN 5 >«gを、 上記と同様に制限酵素 Cfial及び HindlEで切断し、 ポ リアクリルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) の後、 実施例 2の方法 に準じて、 ヒ ト TN F遺伝子全域を含む約 4 9 Opbの DNA断片
    [0191] ( C fia I^→H ind!E ) をポリアク リルアミ ドゲルより回収した。
    [0192] こう して得られた、 ブラスミ ド pA A 1の大部分を含む約 2 · 7 Kbp の D NA断片と ヒ ト TN F遺伝子全域を含む約 49 Obpの DNA断片と を混合し、 ェタノール沈殿の後、 実施例 3の方法に準じて、 T 4 - DN Aリガーゼによる連結反応を行なった。 反応終了後、 実施例 3の方法に 準じて、 ェシエリ ヒア · コリ 6 0 Or-m-株に導入し、 形質転換株の中 より 目的のプラスミ ド PTN F 40 1 A (約 3.2 Kbp) を有するクロー ンを選択した。 このプラスミ ドは、 ヒ ト TNF遗伝子をより効率良く発 現させる能力を有しており、 第 8図にその作成方法を示した。
    [0193] 実施例 5 (抗腫瘍活性ポリペプチ ド遺伝子発現型ブラスミ ドの作成） [TN F 6 1 6 ~PT NF 62 0、 PTN F 633、 PTN F 634、 P TN F 642、 PTN F 643の作成]
    [0194] 実施例 4で得られたヒ ト TNF遺伝子発現型ブラスミ ド pTNF 40 1 A 20 ;«gを、 実施例 4の方法に準じて制限酵素 C£al及び Hindnで 切断し、 ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5%) 及びァガロ ースゲル電気泳動 （ゲル渙度 0.8%) の後、 それぞれ実施例 2及び 3 の方法に準じて、 生成する 2つの DN A断片 （約 490 bp及び約 2.7 K p, 両方共 Cfial^HindlE) をゲルより回収した。
    [0195] ここで得られたヒ ト TN F遺伝子全域を含む約 490 の0 断片 を の 1 0mM Tris— H Cfi (pH 7.4)、 1 0 mM MgS O 、 I mMジチオスレィ トール水溶液に溶解させ、 1 0ュニッ トの制限酵素 Hap II (宝酒造） を添加して、 37 °Cで 1時間切断反応を行なった。 反 応終了後、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル漉度 5%) を行ない、 実施例 2の方法に準じて、 ヒ ト TNF遺伝子の大部分を含む約 390bP の DNA断片 （Hapl——Hindm) をポリアクリルアミ ドゲルより回収 した。 また、 第 9図記載の塩基配列を有するオリゴヌク レオチ ドを、 実施例 2の方法に準じて、 合成、 精製した。 得られた 4本の合成オリゴヌク レ ォチ ドそれぞれ 0.5 >«gについて、 実施例 3の方法に準じて、 末端のリ ン酸化を行ない、 アニーリングの後、 T 4 - DN Aリガーゼによる連結 反応を行なった。
    [0196] 反応終了後、 得られた 2本鎖オリゴヌク レオチ ドを、 先に得られた約 2.7 Kbpの DNA断片 （Cfia indm) 及びヒ ト TN F遺伝子の大 部分を含む約 3 9 Obpの DN A断片 （HapH÷→HindHI) と混合し、 ェ タノ ール沈澱の後、 実施例 3の方法に準じて、 T 4 - DNAリガーゼに よる連結反応を行なった。 反応終了後、 実施例 3の方法に準じてユシェ リ ヒア · コリ C 6 0 Or-m-株に導入し、 形質転換株の中より 目的のプ ラ スミ ド pTN F 4 7 1 (約 3.2 Kbp) を有するク口一ンを選択した。 このプラスミ ドは、 次のァミ ノ酸配列
    [0197] [N H2]-Arg-Lys-Arg-X- I le- I le- A le- L eu- [ C O O H] (但し Xの定義は前記と同じ）
    [0198] で表わされる抗腫瘍活性ポリベプチ ドまたはそのァミ ノ末端に Metが結 合しているポリペプチ ドをコー ドする発現型ブラスミ ドであり、 第 9図 にその作成方法を示した。
    [0199] —方、 上記で得られたヒ ト TN F遺伝子発現型ブラスミ ド pTN F 4 7 1 2 0 gを、 実施例 4の方法に準じて制限酵素 HindDIで切断した 後、 5 0mM Tris- H Ci2 (pH 7.4 ) 、 1 0 0 mM NaCfi、 1 0m M MgS 04水溶液中で制限酵素 Ncol (宝酒造） による切断反応を 3 7 °Cで 1時間行なう。 反応終了後、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル澳度 0.7 %) 及びポリアク リルァミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) を行 ない、 実施例 2の方法に準じて、 ヒ ト T N F遺伝子の一部を含む約 1 4 01^の0 八断片 （Nco I—— H indHI) をポリアクリルァミ ドゲルより、 そして実施例 3の方法に準じて、 PTN F 4 7 1の大部分を含む約 3.0 Kbpの DNA断片 （Nco I -→H indUI) をァガロースゲルより、 それぞ れ回収した。
    [0200] さらに、 上で得られた約 1 4 01^の]31^八断片 （Ncol Hindffi) を 5 0 の 1 OmM Tris- H Cfi (pH 7.4) 、 1 0 mM MgS 04、 I mMジチオスレィ トール水溶液に溶解させ、 1 0ュニッ トの制限酵素 Accl (宝酒造） を添加して、 3 7 °Cで 1時間切断反応を行なった。 反 応終了後、 ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 8 %) を行ない、 実施例 2の方法に準じて、 ヒ ト TNF遺伝子の一部を含む約 1 1 Obpの DN A断片 （Ncol— Accl ) をポリアクリルァミ ドゲルより回収した。 また、 第 1 0図の A記載の塩基配列 No.6 1 6を有するオリゴヌクレ チドを、 実施例 2の方法に準じて、 合成、 精製した。 得られた 2本の合 成オリゴヌク レチ ドそれぞれ 0.5 gについて、 実施例 3の方法に準じ て、 末端のリ ン酸化を行ない、 アニーリングを行なった。
    [0201] アニーリ ングの後、 得られた 2本鎖オリゴヌクレチ ドを、 先に得られ た約 3.0 Kbpの DN A断片 （Nco i HindlH) 及びヒ ト TNF遣伝子 の一部を含む約 1 1 Obpの DNA断片 （NcoI^AccI ) と混合し、 ェ タノ ール沈殿の後、 実施例 3の方法に準じて、 T 4 - DNAリガーゼに よる連結反応を行なった反応終了後、 実施例 3の方法に準じてェシェリ ヒア ' コリ C 6 0 0r-m-株に導入し、 形質転換株の中より 目的のブラ スミ ド PTN F 6 1 6 (約 3.2 Kbp) を有するク口一ンを選択した。 こ のブラスミ ドは、 次のァミ ノ酸配列 [H 2N]-Arg-Lys-Arg-X- I le- I le- A le- P he— [ C O O H ]
    [0202] (但し Xの定義は前記と同じ）
    [0203] で表わされる抗腫瘍性ポリペプチ ドまたはそのアミ ノ末端に Metが結合 しているポリベプチ ドをコ一ドする抗腫瘍活性ポリベプチ ド遣伝子発現 型プラスミ ドであり、 第 1 0図の Bにその作成方法を示した。
    [0204] 上記の方法において第 1 0図の A記載の塩基配列 No.6 1 6のかわり に第 1 0図の A記載の下記の塩基配列を有するォリゴヌク レチドを用い、 それぞれ対応する番号のプラスミ ドを得た。
    [0205] 塩基配列 プラスミ ドにコードされるポリペプチド
    [0206] の番号 プラスミ ド のアミ ノ酸配列
    [0207] No.617 PTNF617 (H2N)-(Met)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-I le-Ala-Trp-(COOH)
    [0208] No.618 PTNF618 (H2N)-(Met)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-I le-Trp-Leu-(COOH)
    [0209] No.619 PTNF619 (H2N)-(Met)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-I le-Phe- Leu- (COOH)
    [0210] No.620 PTNF620 (H2N)- (Met)n-Arg- Lys- Arg- X- I le- I le- Ala- Leu-Phe
    [0211] (COOH)
    [0212] No.633 PTNF633 (H2N)-(Met)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-I le-Phe-Phe-(COOH) No.634 PTNF634 (H2N)-(Met)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-I le-Trp-Phe-(COOH) No.642 PTNF642 (H2N)- (Met)n- Arg-Lys- Arg- X-Phe- 1 le- Ala- Leu-(COOH) No.643 PTNF643 (H2N)-(Met)n-Arg-Lys-Arg-X-I le-Phe-A la-Leu- (COOH)
    [0213] (但し n及び Xの定義は前記と同じ） [TN F 6 2 1 ~PTN F 6 3 2の作成]
    [0214] 実施例 4で得られたヒ 卜 TN F遺伝子発現型ブラスミ ド pTN F 4 0 1 A 2 0 を、 実施例 4の方法に準じて制限酵素 Cfial及び HindlEで 切断し、 ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) 及びァガロ ースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0 .8 %) の後、 それぞれ実施例 2及び 3 の方法に準じて、 生成する 2つの DN A断片 （約 490 bp及び約 2.7 Kbp、 両方共 Cfia I— H indn) をゲルよ り回収した。
    [0215] ここで得られたヒ ト TNF遺伝子全域を含む約 49 ObpのDNA断片 を 5 0 βの l OmM Tris- H Ci2 (pH 7.5 ) 、 60 mM NaCな、 7mM MgC 水溶液に溶解させ、 1 0ユニッ トの制限酵素 Aval (宝 酒造） を添加して、 37 °Cで 1時間切断反応を行なった。 反応終了後、 ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5%) を行ない、 実施例 2 の方法に準じて、 ヒ ト TNF遣伝子の大部分を含む約 46 Obpの DN A 断片 （Aval HindlH) をポリアク リルアミ ドゲルより回収した。
    [0216] また、 第 1 1図記載の塩基配列を有する 2本鎖オリゴヌクレオチ ドを、 実施例 2の方法に準じて、 上の鎖と下の鎮とに分けて合成、 精製した。 得られた 4本の合成ォリゴヌクレオチ ドそれぞれ 0.5 について、 実 施例 3の方法に準じて、 末端のリン酸化を行ない、 アニーリ ングさせた。 ァニーリング後の 2本鎖ォリゴヌクレオチ ドを、 先に得られた約 2. 7 Kbpの DNA断片 （Cfial^→ Hindi!) 及びヒ ト TNF遺伝子の大部 分を含む約 46 Obpの DN A断片 （AvaH HindDI) と混合し、 エタ ノール沈殿の後、 実施例 3の方法に準じて、 T 4 - DNAリガーゼによ る連結反応を行なった。 反応終了後、 実施例 3の方法に準じてェシエリ ヒア ' コリ C 60 Ori-株に導入し、 形質転換株の中より目的のプラス ミ ド PTNF 4 1 6 A (約 3.2 Kbp) を有するクローンを選択した。 こ のブラスミ ドは TNFのァミ ノ末端の 7アミ ノ酸を欠失させた形の抗腫 瘍活性ポリベプチドをコ一ドする抗腫瘍活性ポリベプチド遺伝子発現型 プラスミ ドであり、 第 1 1図にその作成方法を示した。
    [0217] 一方、 上記で得られた発現型ブラスミ ド pTN F 4 1 6 A 20 を、 実施例 4の方法に準じて制限酵素 Hindfflで切断した後、 5 0mM Tri s- H Ci2 (pH 7.4 ) 、 1 0 0 mM NaC£、 1 0 mM MgS 04水溶液 中で制限酵素 N co I (宝酒造） による切断反応を 3 7 °Cで 1時間行なう。 反応終了後、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0.7 %) 及びポリア ク リルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) を行ない、 実施例 2の方法 に準じて、 ヒ ト TN F遺伝子の一部を含む約 1 4 ObpのDNA断片 (Nco I-^H indffi) をポリアク リルアミ ドゲルより、 そして実施例 3 の方法に準じて、 pTN F 4 i 6 Aの大部分を含む約 3.0 Kbpの D N A 断片 （Ncol— Hindm) をァガロースゲルよ り、 それぞれ回収した。 さらに、 上で得られた約 1 4 Obpの DNA断片 （Ncol Hindm) を 5 0 flの 1 0mM Tris-H Ci2 (pH 7 · 4 ) 、 1 0 mM MgS O" I mMジチオスレィ トール水溶液に溶解させ、 1 0ュニッ 卜の制限酵素 Accl (宝酒造） を添加して、 3 7 °Cで 1時間切断反応を行なった。 反 応終了後、 ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル漉度 8 %) を行ない、 実施例 2の方法に準じて、 ヒ ト TN F遺伝子の一部を含む約 1 1 Obpの DNA断片 （Ncol—A cc I ) をポリアク リルアミ ドゲルよ り回収した。 また、 第 1 2図記載の塩基配列を有するオリゴヌク レオチ ドを、 実施 例 2の方法に準じて、 合成、 精製した。 得られた 2本の合成オリゴヌク レオチ ドそれぞれ 0.5 gについて、 実施例 3の方法に準じて、 末端の リ ン酸化を行ない、 アニーリ ングを行なった。
    [0218] アニーリ ングの後、 得られた 2本鎮オリゴヌク レオチ ドを、 先に得ら れた約 3.0 Kbpの D N A断片 （Nco I"H indl) 及びヒ ト T N F遺伝 子の一部を含む約 1 1 Obpの DNA断片 （Ncol— Accl ) と混合し、 エタ ノール沈澱の後、 実施例 3の方法に準じて、 T 4 - DNAリガーゼ による連結反応を行なった。 反応終了後、 実施例 3の方法に準じてェシ エリ ヒア ' コリ C 6 0 0 r-m-株に導入し、 形質転換株の中より 目的のブ ラスミ ド pTNF 6 2 1 (約 3.2 K p) を有するクローンを選択した。 このプラスミ ドは、 次のァミ ノ酸配列
    [0219] CH2N)-Pro-S er-Asp-X- I le- I le - A la - Phe- (C O O H) で表わされる抗腫瘃性ポリべプチドまたはそのアミ ノ末端に Metが結合 しているボリペプチ ドをコードする抗腫瘍活性ポリぺブチ ド遺伝子発現 型プラスミ ドであり、 第 1 2図にその作成方法を示した。
    [0220] また、 第 1 1図記載の塩基配列を有する合成 DN Aのかわりに第 1 3 図記載の合成 DNA (No.6 2 2 - 6 2 7 ) を用いることにより、 第 1 図に示した 1番目の VaJ2から 1 5 7番目の Leuまでで表わされるアミ ノ 酸いは列において、 ァミ ノ末端側の 1 , 2 , 3 , 4 , 5または 6残基のァミ ノ酸を欠失させた形の配列を有する欠失 TNFをコードする DN A領域 を含むブラスミ ドを作成した。 一方、 第 1 4図記載の方法により、 第 1 図に示した 1番目の Va£から Ϊ 5 7番目の L euまでで表わされるアミノ 酸配列において、 ァミ ノ末端側の 8 , 9 , 1 0 , 1 1または 1 2残基のァ ミ ノ酸を欠失させた形の配列を有する欠失 TNFをコードする DN A領 域を含むブラスミ ドを作成した。 第 1 2図において、 ブラスミ ド PTN F 1 6 Aのかわりに、 こうして得られた欠失 TN Fをコードする DN A配列を含むプラスミ ドを出癸材料と して用いることにより、 第 1図に 示した 1番目の VaJ2から 1 5 7番目の Leuまでで表わされるァミ ノ酸配 列において、 ァミ ノ末端側の 1 , 2， 3， 4， 5 , 6， 8 , 9 , 1 0 , 1 1また は 1 2残基のァミ ノ酸を欠失させ、 かつ 1 5 7番目の Leuの Pheへの置 換を含むような配列を有する新規生理活性ボリベプチドまたはそのァミ ノ末端に Metが結合しているポリベプチ ドをコ一 ドする DN A領域を含 むプラス ミ ド pTNF 6 2 2、 PT N F 6 2 3 ^ PT N F 6 2 4、 PT N F 6 2 5、 PT N F 6 2 6、 PT N F 6 2 7、 PT N F 6 2 8、 PT N F 6 2 9、 PT N F 6 3 0、 PT N F 6 3 1 または pTN F 6 3 2を得ること力 できた。
    [0221] [ p T N F 6 3 7の作成]
    [0222] 上で得られた発現型ブラスミ ド P T N F 4 1 6 Aを、 実施例 3の方法 に準じて制限酵素 EcoR I及び Sal Iで切断し、 ポリアク リルアミ ドゲ ル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) 及びァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0. 8 %) の後、 それぞれ実施例 2及び 3の方法に準じて、 生成する 2つの DN A断片 （約 5 6 0 bp及び約 2.6 Kbp、 両方共 Sal I -EcoR I ) をゲルより回収した。
    [0223] ここで得られた抗腫瘍活性ボリベプチ ド遺伝子の 5 '側半分を含む約 5 6 01^の01^ 断片を 5 の 1 OmM Tris-H CJ2 (pH 7.4 ) 、 1 OmM MgS O 1 mMジチオスレィ トール水溶液に溶解させ、 1 0 ユニッ トの制限酵素 Kpn l (宝酒造） を添加して、 3 7でで 1時間切断 反応を行なった。 反応終了後、 ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル 濃度 5 %) を行ない、 実施例 2の方法に準じて抗腫瘍活性ポリペプチ ド 遺伝子の 5 '側の部分を含む約 5 0 0 bPの DNA断片 （EcoR I ^Kpn I ) をポリアク リルアミ ドゲルより回収した。
    [0224] また、 第 1 5図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ ドを、 実施 例 2の方法に準じて、 合成、 精製した。 得られた 2本の合成オリゴヌク レオチ ドそれぞれ 0.5 gについて、 実施例 3の方法に準じて、 末端の リ ン酸化を行ない、 アニーリ ングの後、 T 4— D N Aリガーゼによる連 結反応を行なった。
    [0225] 反応終了後、 得られた 2本鎖オリゴヌク レオチ ドを、 先に得られた約 2.6 Kbpの DN A断片 （Sal I -EcoR I ) 及び抗腫瘍活性ポリぺブ チド遺伝子の 5 '側の部分を含む約 5 0 Obpの DN A断片 （EcoR I *→ Kpnl ) と混合し、 エタ ノール沈澱の後、 実施例 3の方法に準じて、 Τ 4一 DN Αリガーゼによる連結反応を行なった。 反応終了後、 実施例 3 の方法に準じてェシェリ ヒア ' コリ C 6 0 0 r- m-株に導入し、 形質転換 株の中より 目的のブラスミ ド pTN F 6 1 1 (約 3.2 Kbp) を有するク ローンを選択した。 このプラスミ ドは、 次のアミノ酸配列
    [0226] (H2N)-Pro-Ser-Asp-X54-Ile-Ile-Ala-Leu-C00H
    [0227] [但し、 X54は前記定義の Xにおいて 5 4番目 （第 1図のアミ ノ酸 配列の番号） の Glyが Aspに置換されたものを表わす。 ] で表わされる抗腫瘍性ポリベプチ ドまたはそのアミノ末端に Metが結合 しているポリペプチドをコードする発現型ブラスミ ドであり、 第 1 5図 にその作成方法を示した。
    [0228] —方、 上記で得られた発現型ブラスミ ド PTN F 6 1 1 2 0 を、 実 施例 4の方法に準じて制限酵素 Hindmで切断した後、 5 0mM Tris 一 H Ci2(pH 7.4 )、 1 0 OmM NaCj2、 1 0 mM MgS 04水溶液中 で制限酵素 Ncol (宝酒造） による切断反応を 3 7 °0で 1時間行なう。 反応終了後、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0.7 %) 及びポリア クリルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) を行ない、 実施例 2の方法 に準じて、 ヒ ト TN F遺伝子の一部を含む約 1 4 ObpのDNA新片 CNco I indm) をポリアクリルアミ ドゲルより、 そして実施例 3 の方法に準じて、 pTNF 6 1 1の大部分を含む約 3.0 Kbpの DN A断 片 （Ncol HindlD) をァガロースゲルより、 それぞれ回収した。
    [0229] さらに、 上で得られた約 1 4 01^の01^八断片 （Ncol *→H indl) を の 1 0mM Tris— H Ci2(pH 7.4 ) 、 1 0 mM MgS 04、 1 mMジチオスレィ トール水溶液に溶解させ、 1 0ユニッ トの制限酵素 Acc I (宝酒造） を添加して、 3 7 °Cで 1時間切断反応を行なった。 反 応終了後、 ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 8 %) を行ない、 実施例 2の方法に準じて、 ヒ ト TN F遺伝子の一部を含む約 1 1 Obpの DN A断片 （Ncol - Acc I ) をポリアク リルァミ ドゲルより回収した。 また、 第 1 6図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ ドを、 実施 例 2の方法に準じて、 合成、 精製した。 得られた 2本の合成オリゴヌク レオチ ドそれぞれ 0.5/"gについて、 実施例 3の方法に準じて、 末端の リン酸化を行ない、 ァニーリ ングを行なった。
    [0230] アニーリ ングの後、 得られた 2本鎖オリゴヌク レオチ ドを、 先に得ら れた約 3.0 Kbpの D N A断片 （Nco I indffi) 及びヒ ト T N F遺伝 子の一部含む約 1 1 Obpの DNA断片 （NcoI AccI ) と混合し、 ェ タノ一ル沈澱の後、 実施例 3の方法に準じて、 T 4— DNAリガーゼに よる連結反応を行なった。 反応終了後、 実施例 3の方法に準じてエシュ リ ヒア · コリ C 60 Or-m-株に導入し、 形質転換株の中より 目的のブラ スミ ド pT N F 6 3 7 (約 3.2 Kbp) を有するク口一ンを選択した。 こ のプラスミ ドは、 次のァミ ノ酸配列
    [0231] (H2N)-Pro-Ser-Asp-X54-Ile-Ile-Ala-Phe-(C00H)
    [0232] [但し、 X54は前記定義と同じ]
    [0233] で表わされる抗腫瘍性ポリぺプチ ドまたはそのァミ ノ末端に Metが結合 しているボリペプチ ドをコー ドする抗腫瘍活性ポリべプチ ド遺伝子発現 型プラスミ ドであり、 第 1 6図にその作成方法を示した。
    [0234] [TN F 6 4 1の作成]
    [0235] 実施例 4で得られたヒ ト TNF遺伝子発現型ブラスミ ド pTNF 40 l A 20 gを、 1 0 0/^の 1 0mM Tris— HCi2 (PH 7.4)、 1 OmM
    [0236] MgS 04、 1 mMジチオスレイ ト一ル水溶液に溶解させ、 40ュニッ 卜の制限酵素 Kpnl (宝酒造） を添加して、 37 °Cで 1時間切断反応を 行なった。 さらに実施例 3の方法に準じて制限酵素 C Galによる切断を 行ない、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5%) 及びァガロ ースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0.8%) の後、 それぞれ実施例 2及び 3 の方法に準じて、 生成する 2つの DN A断片 （約 1 60 bp及び約 3.0 Kbp、 両方共 Ci2a I Κρη I ) をゲルより回収した。
    [0237] ここで得られたヒ ト TN F遺伝子前半部分を含む約 1 6 ObpのDNA 断片を 50/ ^の 1 OmM Tris— H Cfl (pH 7.4 )、 1 OmM MgS
    [0238] 1 mMジチオスレィ トール水溶液に溶解させ、 1 0ユニッ トの制限 酵素 HapE (宝酒造） を添加して、 37 °Cで 1時間切断反応を行なった t 反応終了後、 ポリアクリルァミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) を行な い、 実施例 2の方法に準じて、 ヒ ト TNF遺伝子の前半部分を含む約 I 00 bpの DNA断片 （C£al HapE) をポリアクリルアミ ドゲルより 回収した。
    [0239] また、 第 1 7図記載の塩基配列を有するオリゴヌク レオチドを、 実施 例 2の方法に準じて、 合成、 精製した。 得られた 2本の合成オリゴヌク レオチドそれぞれ 0.5½について、 実施例 3の方法に準じて、 末端の リン酸化を行ない、 アニーリ ングを行なった。
    [0240] 反応終了後、 得られた 2本鎖オリゴヌク レオチ ドを、 先に得られた約 3.0 Kbpの DNA断片 （Ci2aI "Kpn I ) 及びヒ ト TN F遺伝子の前 半部分を含む約 1 0 ObpのDNA断片 （Cfia I HapH ) と混合し、 ェ タノ ール沈澱の後、 実施例 3の方法に準じて、 T 4—DNAリガーゼに よる連結反応を行なった。 反応終了後、 実施例 3の方法に準じてエシュ リ ヒア . コリ C 6 0 Or-m-株に導入し、 形質転換株の中より 目的のブラ スミ ド pTN F 4 8 9 (約 3.2 KbP) を有するクローンを選択した。 こ のプラスミ ドは、 次のアミ ノ酸配列
    [0241] (H2 )-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-X45， "- 1 le-I le
    [0242] -Ala-Leu-(COOH)
    [0243] [但し、 X45，47は Xの配列において第 1 図で示す 4 5番目の Aspを
    [0244] Asnに、 4 7番目の Ginを Serに置換したものである。 ]
    [0245] で表わされる抗腫瘍性ポリベプチ ドまたはそのアミ ノ末端に Metが結合 しているポリペプチ ドをコー ドする抗腫瘍活性ポリベプチ ド遺伝子発現 型ブラスミ ドであり、 第 1 7図にその作成方法を示した。
    [0246] 次に、 ここで得られたプラスミ ド pTN F 4 8 9 5 gを、 5 Ο βの
    [0247] 1 OmM Tris - H Cfi(pH 7.5 )：、 6 0 mM NaC)2、 7 mM MgS 04水溶液に溶解させ 2 0ュニッ 卜の制限酵素 Ci2al及び 2 0ュニッ 卜 の制限酵素 Aval (宝酒造） を添加し、 3 7 °Cで 1時間切断反応を行なつ た。 そして、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0.7 %) の後、 実施 例 3の方法に準じて、 ブラ スミ ド PT N F 4 8 8の大部分を含む約 3.2 K bpの D N A断片 （ C £a I -Ava I ) をァガロースゲルより回収した。
    [0248] —方、 第 1 8図記載の塩基配列を有するォリゴヌクレオチ ドを、 実施 例 2の方法に準じて、 合成 *精製した。 得られた 4本の合成オリゴヌ ク レオチ ドそれぞれ 0.5; ^を、 第 1 8図記載の組合せで混合し、 ァニー リングを行なった後、 先に得られた約 3.2 Kbpの DN A断片 （Cfial Aval ) と混合する。 エタ ノ ール沈澱の後、 実施例 3の方法に準じて、 T 4—DN Aリガーゼによる連結反応を行なった。 反応終了後、 実施例 3の方法に準じてェシェリ ヒア · コリ C 6 0 Or- m-株に導入し、 形質転 5 換株の中より目的のプラスミ ド pTN F 4 9 7 A又は pTN F 49 7 B 〔いずれも約 3.2 Kbp) を有するクローンを選択した。 これらのブラ スミ ドは、 次のアミ ノ酸配列
    [0249] (H2N)-Pro-Ser-Asp-X45， 47- 1 le- 1 le- Ala- Leu- (G00H)
    [0250] [但し、 X",47は前記に同じ。 ]
    [0251] 10 で表わされる抗腫瘍性ポリぺプチドまたはそのァミ ノ末端に Metが結合 しているポリペプチドをコードする抗腫瘍活性ポリべプチ ド遺伝子発現 型ブラスミ ドであり、 第 1 8図にその作成方法を示した。
    [0252] 次に、 上記で得られたヒ ト TN F遺伝子発現型ブラスミ ド pTN F 4 9 7 B 2 を、 実施例 4の方法に準じて制限酵素 Hindmで切断し i s た後、 5 0mM Tris— H Ci2(pH 7.4 ) 、 1 0 0 raM NaCi2、 1 0m M MgS 04水溶液中で制限酵素 Ncol (宝酒造） による切断反応を 3 7 °Cで 1時間行なう。 反応終了後、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 0 - 7 %) 及びポリアク リルァミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 5 %) を行 ない、 実施例 2の方法に準じて、 ヒ ト TNF遺伝子の一部を含む約 1 4 0 0 bpの D N A断片 （Nco I "HindU) をポリアクリルァミ ドゲルより、 そして実施例 3の方法に準じて、 PT N F 4 9 7 Bの大部分を含む約 3. 0 Kbpの DN A断片 （Ncol indH) をァガロースゲルより、 それ ぞれ回収した。
    [0253] さらに、 上で得られた約 1 4 0 bpの D N A断片 （Nco I -HindM) を 5 の l OmM Tris— H Ci2(pH 7.4 ) 、 1 0 mM MgS 04、lm Mジチオス レィ トール水溶液に溶解させ、 10ユニッ トの制限酵素 Acc I (宝酒造） を添加して、 3 7 °Cで 1時間切断反応を行なった。 反応終了 後、 ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 （ゲル濃度 8 %) を行ない、 実施 例 2の方法に準じて、 ヒ ト TN F遺伝子の一部を含む約 1 1 Obpの DN A断片 （ N co I Acc I ) をポリアクリルアミ ドゲルより回収した。 また、 第 1 9図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ ドを、 実施 例 2の方法に準じて、 合成、 精製した。 得られた 2本の合成オリゴヌク レオチ ドそれぞれ 0.5 ^について、 実施例 3の方法に準じて、 末端の リン酸化を行ない、 アニーリ ングを行なった。
    [0254] アニー リ ングの後、 得られた 2本鎖オリゴヌク レオチ ドを、 先に得ら れた約 3 · 0 Kbpの DN A断片 （Ncol HindDI) 及びヒ ト TNF遺伝 子の一部含む約 1 1 Obpの DNA断片 （NcoI AccI ) と混合し、 ェ タノール沈澱の後、 実施例 3の方法に準じて、 T 4一 DNAリガーゼに よる連結反応を行なった。 反応終了後、 実施例 3の方法に準じてエシュ リ ヒア ' コリ C 6 0 Or- m-株に導入し、 形質転換株の中より 目的のブラ スミ ド pTNF 6 1 (約 3.2 Kbp) を有するクローンを選択した。 こ のプラスミ ドは、 次のァミ ノ酸配列
    [0255] (H2N)- Pro- Ser-Asp- X" , 47-I le- 1 le- Ala-Phe- (C00H)
    [0256] [但し、 X45,47は前記に同じ]
    [0257] で表わされる抗腫瘍性ポリペプチ ドまたはそのアミ ノ末端に Metが結合 しているポリベプチ ドをコ一ドする抗腫瘍活性ポリベプチ ド遺伝子発現 型プラスミ ドであり、 第 1 9図にその作成方法を示した。
    [0258] 実施例 6 (発現の確認） 前記実施例 4で得られたヒ ト TNF遺伝子発現型ブラスミ ド pTNF 4 0 1 A、 実施例 5で得られた発現型ブラスミ ド pTNF 4 7 1又は発 現型プラスミ ド pTNF 6 1 6を有するェシエリ ヒア · コリ C 6 0 0 ri -株を 3 0— 5 0 gZmflのァンピシリ ン、 0.2 %のグルコ一ス及び 4 Ζπώのカザミ ノ酸を含む M 9培地 [0.6 %NaH P 04— 0.3%Κ2Η Ρ Ο 4- 0 - 0 5 %NaCi2-0 - 1 %NH4Cfi水溶液 （pH 7.4) をオート クレーブ滅菌した後に、 別途にォートクレーブ滅菌した MgS 04水溶液 及び CaCfi 2水溶液をそれぞれ最終濃度 2 ιηΜ及び 0.1 mMになるよう に加える。 ] 2 5 0 mflに接種し、 OD6。。が 0.7に達するまで、 3 7 °C で振とう培養を行なった。 次いで、 最終濃度 5 O gZmfiの 3— / S—イ ン ドールァク リル酸を培養液中に添加し、 さらに 3 7 °0で 1 2時間振とう 培養を銃けた。
    [0259] 遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、 P B Sバッファ一（1 5 OmM NaCi2を含む 2 OraMリン酸バッファ一、 pH 7. 4) を用いて菌体の洗 浄を行なつた。 洗浄後の菌体を 1 0 mfiの P B Sバッファーに懸濁させ、 超音波発生装置 （久保田、 2 0 0 M型） を用いて菌体を破壊した後、 遠 心分離により菌体残渣の除去を行なった。
    [0260] 得られた大腸菌ライゼ一卜の一部に対して、 Tris- H Cfiバッファー (PH 6 .8) 、 S D S、 2—メルカプトエタノール、 グリセロールを、 それぞれ最終濃度 6 OmM、 2 %、 4 %、 1 0 %になるように加え、 S D S—ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動 [鈴木、 遺伝、 3 1、 4 3 ( 1 9 7 7) ] を行なった。 分離用ゲルは i 5 %と し、 泳動バッファ一は S D S、 Tris-グリ シン系 [U.K. Laemmli, Nature, 2 2 7、 6 8 0 ( 1 9 7 0 ) ] を用いた。 電気泳動終了後、 ゲル中の蛋白質をクーマ シーブルー; - 2 5 0 (バイォ ' ラッ ド） で染色し、 ヒ ト TNF遺伝子 及び新規抗腫瘍活性ポリべプチ ド遺伝子の発現の確認を行なった。 結果 の一部を第 2 0図に示した。
    [0261] なお、 染色後のゲルをク口マ ト · スキャナー （島津、 C S— 9 3 0型） にかけて、 産生された抗腫瘍活性ポリベプチ ドの大腸菌細胞質蛋白質中 にしめる割合の算出を行なった。 その結果、 ヒ ト TN F遺伝子発現型ブ ラスミ ド pTNF 4 0 1 Aを有する大腸菌においては全細胞質蛋白質 の約 1 9 .4.%の産生が、 また発現型ブラスミ ド PT N F 4 7 1 を有す る大腸菌においては全細胞質蛋白質の約 2 0.3 %の産生が、 また発現 型プラスミ ド pTNF 6 1 6を有する大腸菌においては同じく約 2 4.4 %の抗腫瘍活性ポリべプチ ドの産生が、 それぞれ認められた。
    [0262] 実施例 7 (活性の評価）
    [0263] 抗腫瘍活性ポリべプチ ドの in vitro抗腫瘍活性測定は、 前記 Ruffの 方法に準じて行なった。 すなわち、 実施例 6で得られた抗腫瘍活性ポリ ぺプチ ドを含む大腸菌ラィゼー 卜を順次培地で希釈した試料 1 0 0/ と、 4 X 1 05個 Zfflfiの濃度のマウス L - 9 2 9繊維芽細胞 （ATC C C C L - 9 2 9 ) 懸濁液 1 0 Ο βを、 9 6穴の組織培養用マイクロプレー ト （コースター） 内で混合した。 なおこの際に、 最終濃度 l gZmfiのァ クチノ マイ シン D (コスメゲン、 萬有製薬） を添加しておく。 培地と し ては、 5 % (volZvol)のゥシ胎児血清を含むイーグルのミニマム . ェ ッセンシャル培地 （日水製薬） を用いた。 上記マイクロプレー トを、 5 %炭酸ガスを含む空気中、 3 7 °Cで 1 8〜 2 0時間培養した後、 ク リ ス タル · バイ オレツ 卜溶液 [ 5 % (vol/vol) メ タ ノ ール水溶液に、 0. 5 % (wt/vol) のク リ スタル · バイ オレッ トを溶解させたもの] を用 いて生細胞を染色した。 余分なク リ スタル ·バイォレツ トを洗い流し乾 燥した後、 残ったク リ スタル ' バイオレッ トを 1 0 0 の 0.5 % S D S水溶液で抽出し、 その 5 9 5nmにおける吸光度を E L I S Aアナライ ザ一 （東洋測器、 £丁丫— 9 6型） で測定する。 この吸光度は、 生き残つ た細胞数に比例する。 そこで、 抗腫瘍活性ボリペプチド等を含む大腸菌 ライゼートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の 5 0 %の値に相当する 大腸菌ライゼ一トの希釈倍率をグラフ （たとえば第 2 1図） によって求 め、 その希釈倍率をュニッ トと定義する。 第 2 1図より、 発現型ブラス ミ ド pTN F 4 0 1 Aにコードされるヒ ト TN F蛋白質を含む大腸菌ラ ィゼート 1 0 0 £は 7.6 X 1 06ュニッ ト程度の活性を、 発現型ブラス ミ ド pTNF 4 7 1にコー ドされる抗腫瘍活性ポリベプチ ドを含む大腸 菌ライゼート 1 0 は約 6.9 X 1 07ュニッ ト程度の活性を、 そして 発現型ブラスミ ド pTN F 6 1 6にコードされる抗腫瘍活性ポリベプチ ドを含む大腸菌ラィゼート 1 0 は約 1.9 X 1 08ュニッ ト程度の活 性を、 それぞれ有していることが明らかになった。
    [0264] 実施例 6で得られた各種大腸菌ラィゼート中に含まれる総蛋白質量は、 プロテイ ン * アツセィ ♦ キッ ト （バイオ . ラッ ド） を用いて定量し、 ゥ シ血清アルブミンを用いた検量線より計算した。 上記で得られた発現量、 活性の値及ぴ蛋白質定量結果より抗腫瘍活性ポリベプチド等の比活性を 計算したところ、 表 1のような値が得られた。 表 1 より、 pTNF 6 1 6にコードされる抗腫瘍活性ポリベプチドはヒ ト TNF蛋白質の約 1 8 倍の比活性を、 そして PT N F 4 7 1 にコードされる抗腫瘍活性ボリぺ プチ ドの約 2倍の比活性を有していることがわかる。 ヒ ト TN F蛋白質と本発明の抗腫瘍活性ボリペプチ ドの
    [0265] in vitro 抗腫瘍活性の比較 抗腫瘍活性 抗腫瘍活性 生理活性ポリベプチ ド ヒ ト TN F蛋白質 ポリベプチ ド ポリペプチド プラ ス ミ ド pTNF 401A PT N F 471 pTN F 616 生理活性ポリベプチ ド
    [0266] 大腸菌全細胞質蛋白質 ） 19.4 20.3 24.4 活性（ュニッ ト/ oO -ラィゼ一 卜） 7.6X106 6.9X107 1.9X 108 大腸菌全細胞質蛋白質濃度
    [0267] (TngZmfi-ラ ィ ゼート） 7.1 6.2 7.5 比活性
    [0268] (ュニッ ト/ nig-生理活性ポリべプチ ド） 5.5X107 5.5X108 l.OxlO9
    [0269] 実施例 8
    [0270] 実施例 5において作成した各プラスミ ドを有する大腸菌について実施 例 6及び 7に準じて、 発現の確認及び in vitro 抗腫瘍活性を評価した。 なお、 必要に応じて、 ブラスミ ド PT N F 4 0 1 Aや pTNF 4 7 1を有 する大腸菌を対照と して合せて評価した。
    [0271] [TN F 6 1 7にコードされる抗腫瘍活性ポリぺプチドの評価] 実施例 6に準じて抗腫瘍活性ポリベプチ ドの大腸菌細胞質蛋白質中に しめる割合の算出を行なった。 その結果、 ヒ ト TNF遺伝子発現型ブラ スミ ド pTNF 4 0 1 Aを有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約 1 6.2 %の、 発現型プラスミ ド PTN F 4 7 1 を有する大腸菌において は全細胞質蛋白質の約 2 3.2 %の、 抗腫瘍活性ポリベプチド遺伝子発 現型ブラスミ ド pTN F 6 1 7を有する大腸菌においては同じく約 1 8. 7 %の抗腫瘍活性ボリベプチドの產生が、 それぞれ認められた。
    [0272] 実施例 7に準じて抗腫瘍活性ポリべプチド等を含む大腸菌ライゼ一ト の希釈溶液を加えない対照の吸光度の 5 0 %の値に相当する大腸菌ライ ゼートの希釈倍率をグラフ （たとえば第 2 2図） によって求め、 その希 釈倍率をュニッ トと定義する。 第 2 2図より、 発現型ブラスミ ド pTN F 4 0 1 Aにコー ドされるヒ 卜 TN F蛋白質を含む大腸菌ラィゼート 1 0 は 3.3 x 1 06ュニッ ト程度の活性を、 発現型ブラスミ ド pTN F 4 7 1にコ一 ドされる抗腫瘍活性ポリベプチ ドを含む大腸菌ラィゼ一 ト 1 0 は約 3.7 X 1 07ュニッ ト程度の活性を、 そして発現型ブラ スミ ド pTN F 6 1 7にコー ドされる抗腫瘍活性ポリベプチドを含む大 腸菌ラィゼー ト 1 0 は約 4.0 X 1 07ュニッ ト程度の活性を、 それ ぞれ有していることが明らかになつた。 各種大腸菌ラィゼー 卜中に含まれる総蛋白質量は、 プロテイ ン · アツ セィ . キッ ト （バイォ . ラッ ド） を用いて定量し、 ゥシ血清アルブミ ン を用いた検量線より計算した。 上記で得られた発現量、 活性の値及び蛋 白質定量結果より抗腫瘍活性ボリべプチ ド等の比活性を計算したところ、 表 4〜 5のような値が得られた。 表 4〜 5より、 PT N F 6 1 7にコ一 ドされる抗腫瘍活性ボリベプチ ドはヒ ト TNF蛋白質の約 1 2倍の比活 性を、 そして PT N F 4 7 1 にコ一 ドされる抗腫瘍活性ポリべプチ ドの 約 1 .4倍の比活性を有していることがわかる。
    [0273] [TN F 6 1 8にコー ドされる抗腫瘍活性ポリべプチ ドの評価] 実施例 6に準じて抗腫瘍活性ポリベプチ ドの大腸菌細胞質蛋白質中に しめる割合の算出を行なった。 その結果、 ヒ 卜 TNF遺伝子発現型ブラ スミ ド pTNF 4 0 1 Aを有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約 1 6 .2 %の産生が、 また発現型ブラスミ ド PT N F 4 7 1 を有する大腸 菌においては全細胞質蛋白質の約 2 3 .2 %の産生が、 また発現型ブラ スミ ド pTN F 6 1 8を有する大腸菌においては同じく約 1 3.5 %の抗 腫瘍活性ポリべプチドの産生が、 それぞれ認められた。
    [0274] 実施例 7に準じて抗腫瘍活性ボリべプチ ド等を含む大腸菌ライゼ一 卜 の希釈溶液を加えない対照の吸光度の 5 0 %の値に相当する大腸菌ラィ ゼー 卜の希釈倍率. グラフ （たとえば第 2 3図） によって求め、 その希 釈倍率をュニッ 卜と定義する。 第 2 3図より、 発現型プラスミ ド pTN F 4 0 1 Aにコー ドされるヒ ト TN F蛋白質を含む大腸菌ラ イゼー ト 1 0 0 ^は 3.8 x 1 06ュニッ 卜程度の活性を、 発現型ブラスミ ド pTN F 4 7 1 にコー ドされる抗腫瘍活性ポリべプチ ドを含む大腸菌ライゼ一 卜 1 0 は約 3.6 x 1 07ュニッ 卜程度の活性を、 そして発現型ブラ スミ ド pTNF 6 1 8にコ一 ドされる抗腫瘍活性ポリベプチ ドを含む大 腸菌ラィゼート 1 0 は約 3.9 X 1 07ュニッ ト程度の活性を、 それ ぞれ有していることが明らかになった。
    [0275] 各種大腸菌ラィゼー 卜中に含まれる総蛋白質量は、 プロティン · アツ セィ ' キッ ト （バイォ♦ ラッ ド） を用いて定量し、 ゥシ血清アルブミ ン を用いた検量線より計算した。 上記で得られた発現量、 活性の値及び蛋 白質定量結果より抗腫瘍活性ポリベプチド等の比活性を計算したところ、 表 4 ~ 5のような値が得られた。 表 4〜 5より、 PT N F 6 1 8にコー ドされる抗腫瘍活性ポリベプチ ドはヒ ト T N F蛋白質の約 1 4倍の比活 性を、 そして PT N F 4 7 1にコー ドされる抗腫瘍活性ポリベプチドの 約 2倍の比活性を有していることがわかる。
    [0276] [TN F 6 1 9にコードされる抗腫瘍活性ボリべプチ ドの評価] 実施例 6に準じて産生された抗腫瘍活性ポリベプチドの大腸菌細胞質 蛋白質中にしめる割合の算出を行なった。 その結果、 ヒ ト TN F遺伝子 発現型ブラスミ ド PT N F 4 0 1 Aを有する大腸菌においては全細胞質 蛋白質の約 1 6.3 %の産生が、 また発現型ブラスミ ド pTN F 4 7 1 を 有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約 1 8 .3 %の産生が、 また 発現型ブラスミ ド pTN F 6 1 9を有する大腸菌においては同じく約 2 0 - 3 %の抗腫瘍活性ポリベプチドの産生が、 それぞれ認められた。
    [0277] 実施例 7に準じて抗腫瘍活性ポリべプチド等を含む大腸菌ライゼ一ト の希釈溶液を加えない対照の吸光度の 5 0 %の値に相当する大腸菌ラィ ゼー 卜の希釈倍率をグラフ （たとえば第 2 4図） によって求め、 その希 釈倍率をュニッ 卜と定義する。 第 2 4図より、 癸現型ブラスミ ド pTN F 4 0 1 Aにコードされるヒ ト TN F蛋白質を含む大腸菌ラィゼー ト 1 0 は 5.3 x 1 06ュニッ ト程度の活性を、 発現型ブラスミ ド pTN F 4 7 1 にコー ドされる抗腫瘍活性ポリべプチ ドを含む大腸菌ラィゼー ト 1 0 は約 5.8 X 1 07ュニッ ト程度の活性を、 そして発現型ブラ スミ ド pTN F 6 1 9にコー ドされる抗腫瘍活性ポリベプチ ドを含む大 腸菌ラィゼー ト 1 0 Ο は約 1 .3 X 1 08ュニッ ト程度の活性を、 それ ぞれ有していることが明らかになった。
    [0278] 各種大腸菌ラィゼ一 ト中に含まれる総蛋白質量は、 プロテイン · アツ セィ ' キッ ト （バイォ ' ラッ ド） を用いて定量し、 ゥシ血清アルブミ ン を用いた検量線より計算した。 上記で得られた発現量、 活性の値及び蛋 白質定量結果より抗腫瘍活性ポリべプチ ド等の比活性を計算したところ、 表 4 ~ 5のような値が得られた。 表 4〜 5より、 pTNF 6 1 9にコー ドされる抗腫瘍活性ポリベプチ ドはヒ ト TN F蛋白質の約 1 8倍の比活 性を、 そして PT N F 4 7 1 にコー ドされる抗腫瘍活性ポリぺプチ ドの 約 2倍の比活性を有していることがわかる。
    [0279] [その他の抗腫瘍活性ポリベプチ ドの評価]
    [0280] 発現型プラスミ ド pTNF 6 2 1にコー ドされる抗腫瘍活性ポリぺプ チ ドを含む大腸菌ラィゼー ト 1 0 は 1 08ュニッ ト程度の活性を有 しており、 ヒ ト TN F蛋白質を含む大腸菌ラィゼー 卜よりも高活性を有 していた。 発現型ブラスミ ド PT N F 6 3 7にコー ドされる抗腫瘍活性 ポリベプチ ドを含む大腸菌ラィゼー ト 1 0 は 2 x 1 03ュニッ ト程 度の活性を有していた。
    [0281] 発現型ブラスミ ド pTNF 6 3 7にコー ドされる抗腫瘍活性ポリぺプ チ ドを含む大腸菌ライゼー ト中に含まれる総蛋白質量は、 プロテイ ン . アツセィ ' キッ ト （バイォ · ラッ ド） を用いて定量し、 ゥシ血清アルブ ミンを用いた検量線より計算した。 上記で得られた活性の値及び蛋白質 定量結果より抗腫瘍活性ポリベプチ ドを含む大腸菌ラィゼー 卜の比活性 を計算したところ、 8.3 X 1 02 (ュニッ ト —蛋白質） の比活性を 有していた。
    [0282] 以下同様に、 PT N F 6 2 0、 6 22、 6 24、 6 2 5、 6 2 6、 6
    [0283] 2 7、 6 2 8、 6 2 9、 6 3 0、 6 3 1、 6 3 2、 6 3 3、 6 3 4、 6 4 2、 6 4 3及び 6 4 1について、 実施例 6及び 7に準じて、 発現の確 認及び in vitro 抗腫瘍活性を評価した。 第 2 5〜3 0図に細胞生存率 vsラィゼー 卜希釈倍率を示した。
    [0284] 結果をまとめて、 大腸菌ライゼ一ト 1 0 0 あたりの活性 （表 1 ) 、 抗腫瘍活性ボリペプチ ドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合 （表 2) 、 ライゼ一ト中の大腸菌全蛋白質濃度 （表 3) 、 抗腫瘍活性ポリぺブチ ド の比活性 （表 4) 、 イ ンタク ト TNF (pT F 4 0 1 Aにコードされ る） の活性を 1 とした場合の抗腫瘍活性ポリベプチドの比活性 （表 5) に示す。 プラスミ ド PT N F 6 1 6、 6 1 7、 6 1 8、 6 1 9、 6 2 0、 6 4 3、 6 4 1 を有する大腸菌により産生された抗腫瘍活性ポリぺプチ ドはインタク ト T N Fにく らべ髙い比活性を有していることがわかる。
    [0285] 2 大腸菌ライゼ一 ト i 0 0/ あたりの活性 (107ュニッ ト ラィゼー ト）
    [0286]
    [0287] 抗腫瘍活性ポリベプチドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合 (抗腫瘍活性ボリペプチ ド/大腸菌全細胞蛋白質、 単位％)
    [0288] ライゼ一 ト中の大腸菌全蛋白質濃度
    [0289] (mg/rnfi—ライゼ一ト）
    [0290] 5 抗腫瘍活性ポリぺプチ ドの比活性
    [0291] (108ュニッ ト Ζι^-抗腫瘍活性ポリべプチ ド） 実 "
    [0292] プラ ス ミ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 l i 12 p T N F 401A 0.55 0.31 0.35 0.50 0.39 0.19 0.75
    [0293] 〃 471 5.5 2.6 2.5 4.4
    [0294] 〃 616 10
    [0295] 〃 617 3.6
    [0296] 〃 618 4.8
    [0297] 〃 619 8.9
    [0298] 〃 620 2.7
    [0299] 〃 633
    [0300] 〃 634
    [0301] 〃 642
    [0302] 〃 643 0.54
    [0303] 〃 621
    [0304] 〃 637
    [0305] 〃 641 1.3
    [0306] O
    [0307] < *—
    [0308] 6 イ ンタク ト （PTN F 40 1 A) を 1 と した場合の 抗腫瘍活性ポリベプチドの比活性
    [0309]
    [0310] 実施例 9 (抗腫瘍活性ポリペプチ ドの分離 ·精製）
    [0311] 実施例 5で得られた PT N F 4 7 1、 PT N F 6 1 6、 PT N F 6 1 9
    [0312] を有する大腸菌のラィゼー トからの抗腫瘍活性ポリベプチ ドの分離 ·精
    [0313] 製は、 カルボキシメチルーセファロース · カラム · クロマ トグラフィー
    [0314] (フアルマシア） を用いて行なった。 まず該樹脂をカラムに詰めた後、
    [0315] 5 OmMクェン酸バッファー （PH 6.2) で十分に平衡化し、 次いで実
    [0316] 施例 2で得られた抗腫瘍活性ポリべプチ ドを含むライゼ一トを該カラム
    [0317] に供する。 その後 P B Sバッファー [ 2 OmMリ ン酸バッファー （pH
    [0318] 7.4) 1 4 OmM NaCi2] で十分に洗浄してから 4 2 OmM NaCfi
    [0319] を含む 2 OraMリン酸バッファー （PH 7.4) を用いて抗腫瘍活性ボリ
    [0320] ぺプチドを溶出させた。 溶出した抗腫瘍活性ポリベプチドを S D S—ポ
    [0321] リアクリルアミ ド ·ゲル電気泳動 （分離用ゲル濃度 1 5 %) にかけ、 電
    [0322] 気泳動終了後、 ゲル中の蛋白質のバンドを色素を用いて染色したところ、 それぞれ分子量約 1 5 , 0 0 0〜1 7 , 0 0 0の位置のみに 1本のパンド
    [0323] が観察されそれぞれ 9 8 %の純度の抗腫瘍活性ポリべプチ ドが得られた
    [0324] ことが確認できた。
    [0325] 実施例 1 0 (精製品の活性の評価）
    [0326] 実施例 9で精製した抗腫瘍活性ポリぺブチドの in vitro 抗腫瘍活性
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1 . 下記式 [ I ]
    [NH2]-( et)„-A-X-B-[C00H] [ I ]
    式中、
    5 nは 0または 1 であり、
    Aは結合手ゝ —Asp—、 —Ser— Asp -、 一 Pro— Ser— Asp または— Arg -: Lys— Arg -を表わし、
    Bは - 1 le - 1 le - Ala - Phe -、 - 1 le - 1 le - Ala-Trp -、 - 1 le - 1 le - Ala - Leu - Phe -、 - 1 le - 1 le - Trp - Leu -、 - 1 le - 1 le-Phe - Leu -、 - 1 le - 1 le - Phe - I Phe -、 - Ile-Ile- Trp- Phe -、 -Ue- Phe- Ala- Leu-または- Phe- 1 ie -
    Ala - Leu-を表わし、 ただし Aが結合手、 -Asp -、 -Ser- Asp-または - Pro- Ser-Asp-の時、 Bは- 1 le- 1 le- Ala- Pheであり、 X (i-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu- Gly-Gln-Leu-Gln-Trp-Leu-Asn-Arg-Arg-Ala-Asn-Ala-Leu-Leu- Ala-Asn-Gly-Val-Glu-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-Val-V l-Pro- Ser-Glu-Gly-Leu-Tyr-Leu-I le-Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys- Gly - Gin - Gly - Cys - Pro - Ser - Thr - His - Vaト leu - Leu - Thr - His - Thr - I le - Ser - Arg - 1 le- Ala - Val - Ser - Tyr - Gin - Thr - Lys - Val - Asn - Leu - Leu - Ser - A la - 1 le-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu- G ly - Ala - Glu - A la - Lys- Pro - Trp - Tyr - Glu - Pro - 1 le - Tyr - Leu - Gly - Gly-Val-Phe-Gln-Leu-Glu-Lys-Gly-Asp-Arg-Leu-Ser-Ala-Glu- 11 e - Asn - Arg - Pro - Asp - Tyr - l<eu - Asp - Phe - A i a - Giu - Ser - Gly - Gin - Val- Tyr- Phe- Gly-を表わす
    で表わされる新規生理活性ポリペプチ ド。
    2 . 前記式 [ I ] において、 Aは- Arg- Lys-Arg-である請求の範囲第 1項のポリぺブチド。
    3. 前記式 [ I ] において、 Aは- Arg- Lys-Arg-であり、 且つ Bは -lie— lie— Aia- Phe -、 - 1 ie- 1 le- Ala- Trp -、 -I le-I le- Trp- Leu-または
    5 -lie- lie- Phe- Leu-である請求の範囲第 1項のポリぺプチ ド。
    4 - 前記式 [ I ] で表わされるポリペプチ ドをコードする DN A配列 を含む組換えプラスミ ド。
    5. 該プラスミ ドは、 pTNF 6 1 6、 PT N F 6 2 1、 pTN F 6 2 8、 PT N F 6 2 9、 PT N F 6 3 0、 PT N F 6 1 7、 PTN F 6 2 0、 o pTN F 6 1 8 v PT N F 6 1 9、 PT N F 6 3 3、 PTN F 6 3 4、 PT N F 6 4 3または PTN F 6 4 2である請求の範囲第 4項のブラスミ ド。
    6. 該プラスミ ドは、 pTNF 6 1 6、 pTN F 6 1 7、 pTNF 6 1 8または PT N F 6 1 9である請求の範囲第 4項のブラスミ ド。
    7 . 前記式 [ I ] で表わされるポリペプチドをコードする DN A配列 5 を含む組換えプラスミ ドにより形質転換された組換え微生物細胞。
    8 - 該微生物細胞がェシエリ ヒア · コリ（Escherichia col i)である請 求の範囲第 7項の微生物細胞。
    9 . 前記請求の範囲第 7項の組換え微生物細胞を培養し、 培養物中に 前記式 [ I ] で表わされるボリペプチ ドを生成蓄積せしめ、 得られた培 0 養物から該ポリべプチ ドを分離することを特徵とする前記式 [ I ] で表 わされるポリぺブチ ドの製造方法。
    1 0 . 該微生物細胞がェシエリ ヒア · コリ（Escherichia coli)である 請求の範囲第 9項のポリぺプチド製造方法。
    1 1 · 前記式 [ I ] で表わされるポリペプチ ドの抗腫瘍有効量及び製 薬学的に許容しえる担体よりなる医薬組成物。
    1 2. 該ポリペプチ ドは、 前記式 [ I ] において Aが- Arg- Lys- Arg- に相当するものである請求の範囲第 1 1項の医薬組成物。
    1 3. 該ポリペプチ ドは、 前記式 [I ]において、 Aが- Arg- Lys- Arg- . であり、 且つ B力；- lie- lie- Aia- Leu -、 -I le- 1 le - Ala - Trp -、 -lie - lie -
    Trp- Leu-または- Ile_Ile- Phe- Leu-であるものに相当する請求の範囲第 1 1項の医薬組成物。
    1 4. 下記式 [ΠΠ
    [NH2]-(Met)„-A,-X-B'-[C00H] [Π]
    > 式中、
    nは 0または 1、
    A,は、 - Arg- Lys - Arg -であり、
    B 'は -lie - lie - Ala - Phe -、 - 1 le - 1 le - Ala - Trp -、 -I le-I le-Ala- Leu - Phe -、 - 1 le - 1 le - Trp - Leu -、 - 1 le- Ue - PheHLeu -、 - lie - lie - Phe - Phe -、 - 1 le - 1 le - Trp - Phe -、 - 1 le - Phe - Ala-Leu -、 - Phe - lie - Ala- Leu-または- lie- lie- Ala- Leu-であり、
    Xは前記式 [ 1〗 における同じ定義のアミ ノ酸配列を表わす で表わされるポリベプチ ドを含有する水性溶液を、
    (1) 陽イオン交換樹脂に接触せしめて、 該陽イオン交換樹脂に、 該ポ リぺプチ ドを吸着せしめ、
    C2) 得られた該ポリペプチ ドが吸着した陽イオン交換樹脂を、 吸着し た該ボリベプチ ドが実質的に溶出しない濃度の塩を含む溶媒で洗滌し、 (3) 次いで、 該ポリペプチ ドが吸着した陽イオン交換樹脂を、 該ポリ ぺプチ ドが溶出しうる濃度の塩を含む溶媒を用いて該ポリベプチ ドを溶 出分離させる
    ことを特徵とする該水性溶液から、 精製された前記式 [ Π] のボリぺプ チドを回収する方法。 .
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    1990-04-05| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
    1990-04-05| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): CH DE FR GB |
    1991-03-21| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1989910674 Country of ref document: EP |
    1991-07-24| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1989910674 Country of ref document: EP |
    1996-06-12| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1989910674 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP63236497A|JPH07110237B2|1988-09-22|1988-09-22|新規生理活性ポリペプチド|
    JP63/236497||1988-09-22||
    JP63296305A|JPH0797998B2|1988-11-25|1988-11-25|新規生理活性ポリペプチド|
    JP63296307A|JPH07110238B2|1988-11-25|1988-11-25|新規生理活性ポリペプチド|
    JP63/296305||1988-11-25||
    JP63/296307||1988-11-25||
    JP63/316453||1988-12-16||
    JP63316453A|JPH07110239B2|1988-12-16|1988-12-16|新規生理活性ポリペプチド|DE1989626679| DE68926679T2|1988-09-22|1989-09-22|Physiologisch aktives polypeptid, rekombinantes plasmid, rekombinante mikrobielle zellen, medizinisches präparat sowie verfahren zur gewinnung des gereinigten polypeptids|
    EP19890910674| EP0437610B1|1988-09-22|1989-09-22|Novel physiologically active polypeptide, recombinant plasmid, recombinant microbial cells, medicinal composition, and process for recovering purified polypeptide|
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